熒光編碼微球的制備研究進展

李 艷 羅 成* 吳道澄

1(宜春學院醫學院，江西 宜春 336000)2(西安交通大學生命科學與技術學院教育部生物醫學信息工程重點實驗室，西安 710049)

熒光編碼微球的制備研究進展

李 艷1羅 成1*吳道澄2

1(宜春學院醫學院，江西 宜春 336000)2(西安交通大學生命科學與技術學院教育部生物醫學信息工程重點實驗室，西安 710049)

懸浮芯片技術是近年來興起的高通量生物檢測技術，在生命科學研究及臨床診斷等領域具有廣泛應用。作為懸浮芯片技術的檢測載體，熒光編碼微球的研究已取得一系列進展。首先對懸浮芯片技術的檢測原理及應用進行簡單介紹，重點對熒光編碼微球的制備方法進行總結，包括有機溶劑溶脹法、層-層自組裝法、包埋法、微流控技術、膜乳化法等，最后對熒光編碼微球未來的發展趨勢進行探討。

懸浮芯片；微球；熒光編碼；量子點

引言

懸浮芯片技術又稱為懸浮陣列和液相芯片，是在傳統平面生物芯片技術基礎上發展起來的高通量生物檢測技術。與平面生物芯片技術相比，懸浮芯片具有多功能性、高敏感性、高通量、高靈活性等優勢[1-3]，被廣泛應用于生命科學研究及臨床診斷等諸多領域。作為最常用的懸浮芯片檢測載體，熒光編碼微球的研究近年來取得了大量進展，涌現了多種多樣的制備方法。下面先對懸浮芯片的檢測原理及應用進行簡單介紹，再重點對熒光編碼微球的制備方法、熒光編碼與其他功能的復合、熒光編碼微球的發展趨勢等進行系統闡述。

1 懸浮芯片技術

1.1 檢測原理

懸浮芯片技術的檢測原理如圖1所示，其中編碼微球作為免疫檢測的載體，所帶有的編碼信息同時用作表面結合探針分子的標記。懸浮芯片技術的分析過程為：目標分子先與編碼微球表面負載的探針分子結合，再進一步與帶有熒光標記的報告分子結合，形成夾心式結構的復合體，微球帶有的編碼信息用于區分目標分子的種類，而報告分子的信號強弱則反映目標分子的含量。

圖1 懸浮芯片技術檢測原理Fig.1 Schematic illustration of suspension array analysis

1.2 技術應用

懸浮芯片技術在基因表達譜分析、基因突變及多態性分析、病原微生物檢測、疾病的早期診斷等方面具有廣泛的應用[4-5]。朱鵬等利用多重PCR、多重等位基因特異性引物延伸反應以及懸浮芯片技術，確定了東方型鼠疫菌中18個單核苷酸多態性(SNP)位點的堿基狀態，并依據這18個SNP將36株東方型鼠疫菌分為7個基因型[6]。Sun等利用多重PCR結合懸浮芯片分析技術,同時鑒定6種食源性致病菌(大腸桿菌O157:H7，志賀氏桿菌，沙門氏菌，副溶血性弧菌，金黃色葡萄球菌，單增李斯特菌)，檢測靈敏度比傳統的PCR法高1～5個數量級，多重檢測的檢測限為1～10 CFU/mL[7]。Nolen等利用懸浮芯片技術，測定了包括83例非小細胞肺癌(NSCLC)、74例良性肺部腫瘤和77例正常人群尿液樣本中的242種生物標志物，并確定了一組針對NSCLC的腫瘤標志物(IGFBP-1，sIL-1Ra，CEACAM-1)，這對區分NSCLC和正常對照組具有很高的特異性[8]。Tong等利用懸浮芯片技術和酶聯免疫吸附試驗，檢測胃癌的10種血清標志物，通過3種診斷算法篩選了5種標志物，該組標志物的含量顯著高于其他細胞因子和標志物，有望提高胃癌的檢測準確性[9]。由于懸浮芯片技術具有高通量、多功能性等優勢，所以在臨床檢驗診斷、環境監測、農業監測等方面具有廣闊的應用前景。

2 熒光編碼微球

2.1 微球編碼方式

微球的編碼方式主要包括光譜編碼(熒光編碼、拉曼編碼、光子晶體反射編碼)、圖形編碼、熒光壽命編碼、衍射及全息編碼等[3,10-11]。相對于其他編碼方式，熒光編碼具有編碼及解碼過程簡單、編碼容量大、可大批量制備等優勢。熒光編碼微球利用熒光發射波長和強度進行編碼，理論上編碼容量C=Nm-1，N是熒光的強度梯度，m是發射波長的數量，1對應所有熒光強度為零的編碼。以3種發射波長、每個發射波長分為10個濃度梯度為例，編碼容量可以達到C=103-1=999。熒光編碼微球可以通過流式細胞儀或者微流控系統進行檢測，分析速度達到幾千甚至幾萬赫茲，因而特別適用于高通量樣本分析。

2.2 熒光編碼元件

熒光編碼微球的編碼元件主要分為有機熒光染料、量子點和上轉換納米顆粒3類[12]。有機熒光染料價格低廉、種類較多，適用于多種編碼方法和多種材質的微球，不同批次間熒光均一性好；缺點在于熒光穩定性差，激發光譜不重疊的染料需要多個激發光源進行激發，因而增加了分析儀器的成本。量子點的發射光譜窄，熒光穩定性好，發射波長可以通過量子點的尺寸和組分進行調節，其較寬的激發光譜可以實現多種量子點的單一波長激發，缺點在于組成量子點的重金屬元素具有一定的毒性。部分有機染料或量子點制備的熒光編碼微球需要較短的激發波長，所以導致較強的背景干擾(瑞麗散射和自發熒光)。上轉換納米顆粒利用近紅外光激發，可以有效避免生物分子背景熒光的干擾，同時利用上轉換納米顆粒編碼，可以避免不同發射波長間的共振能量轉移現象，缺點是具有不同發射波長的上轉換納米顆粒種類較少。

3 熒光編碼微球制備方法

3.1 有機溶劑溶脹法

有機溶劑溶脹法的基本原理為：聚合物微球在有機溶劑中溶脹，染料或量子點等滲透入微球內部；移除有機溶劑后，微球聚合物網絡發生收縮，并將染料或量子點等包裹在微球內部；調整染料或量子點的種類和濃度，可以實現不同的熒光編碼。利用該方法制備的代表性熒光編碼微球是Luminex公司的MicroPlex?微球，是利用紅色和近紅外染料對聚苯乙烯微球進行編碼，兩種染料分別設定10個濃度梯度，得到了100種熒光編碼微球，并開發了與MicroPlex?編碼微球配套的xMAP(multi-analyte profiling)多重樣本分析平臺。新一代的MagPlex?微球在此基礎上增加了第三種熒光染料(5個濃度梯度)，得到了500種編碼微球。基于類似的原理，Han等利用疏水性ZnS-CdSe量子點制備熒光編碼微球，微球的熒光強度與微球內部量子點的數量成線性關系[13]。在單色熒光編碼的基礎上，按照量子點尺寸從大到小的順序，依次負載不同發射波長的量子點，可以實現微球的多色熒光編碼。選用與量子點相同激發波長(350 nm)的染料標記DNA目標分子，可以實現編碼微球和目標分子的單一激發光源的激發。Zhang等利用類似的方法，將上轉換納米顆粒包裹在聚苯乙烯微球內部，調整不同發射波長上轉換納米顆粒的比例，可以獲得不同的熒光編碼微球[14]。上轉換熒光編碼與報告分子染料標記沒有光學交叉，因此標記染料的可選擇范圍很寬(見圖2)。

圖2 不同上轉換納米顆粒編碼微球用于目標分子檢測[14]Fig.2 Microspheres encoded with different upconversion nanoparticles for detection of targeted molecules[14]

為了增加熒光編碼微球的熒光均一性和穩定性，許多學者對有機溶劑溶脹法進行了改進。Wang等利用有機溶劑溶脹-溶劑蒸發法，制備熒光編碼微球[15]。量子點和微球的氯仿溶液在密封條件下攪拌2 h溶脹微球，之后將溶液在空氣氛下攪拌2 h，隨著氯仿的揮發，溶液中量子點的濃度逐漸升高，促使量子點滲入微球內部。該方法可以增加量子點在微球內的包裹效率和分布均一性。Song等利用漸次溶劑蒸發方式，制備熒光編碼微球[16]。微球分散在異丙醇中，與量子點的氯仿溶液混合后，在真空干燥箱中干燥12 h。由于量子點在氯仿中的分散性比在異丙醇中好，干燥過程中氯仿較異丙醇揮發速度快，從而驅動量子點從溶液擴散到微球內部，溶劑完全揮發后得到負載量子點的熒光編碼微球。調整微球制備過程中制孔劑的含量，可以實現量子點在微球內部的均勻分布。

為了避免環境干擾導致量子點從微球中泄露以及量子點熒光變化，Song等利用自愈合法制備熒光編碼微球[17]。整個反應分為溶脹、升溫、脫溶脹和降溫三部分： 多孔聚苯乙烯微球分散在十六烷中，與量子點的氯仿溶液混合后于50℃攪拌1～2 h溶脹微球；在氬氣氛下逐漸升溫至180℃，升溫階段聚合物分子鏈自發運動，微球繼續溶脹，同時氯仿蒸發導致微球內外量子點濃度出現差異，量子點更容易滲透進微球內部。氯仿被除去后，聚合物分子鏈的熱運動和相互作用導致微球孔隙收縮；隨之迅速降溫，微球脫溶脹，聚合物分子鏈再次被固定，從而將量子點牢固限定在微球內部。與傳統有機溶劑溶脹法制備的熒光編碼微球相比，自愈合法制備的熒光編碼微球具有較高的量子點負載量，量子點在微球基質內分布均勻，同時避免了量子點的泄露，提高了熒光編碼微球在不同pH條件下的化學穩定性和長期儲藏穩定性。

3.2 疏水作用結合

Gao等利用介孔二氧化硅微球和三正辛基氧膦(TOPO)修飾量子點之間的強疏水作用，制備熒光編碼微球[18]，編碼過程通過攪拌量子點和微球的混合溶液實現，對于32 nm孔徑的微球，編碼過程只需10 min即可完成。由于介孔微球具有較大的孔徑和比表面積，量子點可以滲透進介孔微球內部，所以該方法制備的熒光編碼微球比有機溶劑溶脹法制備的熒光編碼微球亮度要高50～100倍。量子點表面的TOPO與介孔模板分子疏水碳鏈有多重疏水作用，將量子點牢牢固定在介孔通道內，防止了量子點的解離或泄露。后來，該課題組利用類似的原理，制備了聚苯乙烯熒光編碼微球[19]，微球與量子點的結合快速且定量，上清中幾乎無殘余量子點存在。多孔微球的熒光亮度和均勻度分別是無孔微球的1 000倍和5倍。微球分散在水或極性有機溶劑中無量子點泄露，7種單色編碼和4種雙色編碼微球混合后，可以通過流式細胞儀進行區分。Hu等利用該方法制備量子點摻雜的介孔二氧化硅微球，編碼微球表面結合聚乙烯醇后包裹二氧化硅殼層[20]。二氧化硅包裹后的熒光編碼微球具有非常高的穩定性，避免了溶劑(氯仿)誘導的量子點泄露和化學誘導的熒光猝滅。

3.3 層-層自組裝法

利用聚電解質和相反電性量子點間的靜電吸附作用，可以實現聚電解質和量子點在微球表面的交替結合。調整聚電解質和量子點結合的層數，可以控制微球表面負載的量子點數量[21]。Sukhanova等利用層-層自組裝法，將3種不同發射光譜的量子點分別組裝在三聚氰胺-甲醛樹脂微球表面，利用量子點與報告分子熒光之間的共振能量轉移作用，成功實現了3種目標分子的檢測[22]。Allen等先利用季胺化的苯乙烯-氯甲基苯乙烯共聚物，將疏水性量子點從氯仿轉移到水相，并使量子點帶有正電性，之后將量子點通過層-層自組裝法組裝在二氧化硅微球表面，制備熒光編碼微球[23]。Schnackel等將異硫氰酸熒光素標記的聚烯丙基胺鹽酸鹽(FITC-PAH)和相反電性的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)交替組裝在二氧化硅微球表面[24]，微球的熒光強度可以通過FITC-PAH熒光層的層數以及未做熒光標記的PAH和FITC-PAH之間的比例進行調整。

3.4 表面交聯法

為了實現微球表面的固相引物合成，Nanthakumar等利用高度交聯、非溶脹的聚苯乙烯微球，通過在微球表面共價交聯BODIPY染料分子，實現熒光編碼寡核苷酸合成載體的制備[25]。微球表面交聯的染料數量由染料的濃度決定，利用濃度逐級稀釋(10倍)的染料溶液，得到4種強度的熒光編碼。Kozak等在有機硅微球表面共價交聯熒光染料Atto-Tech 550和620[26]，通過改變兩種染料的濃度獲得了41種熒光編碼微球，并通過表面引發的可逆加成-斷裂鏈轉移反應，在微球表面生成了一層蛋白質抵抗聚合物層，減少了97%的非特異性蛋白質吸附。

3.5 包埋法

3.5.1 有機染料編碼

Zhang等利用單分散聚苯乙烯微球進行種子聚合[27]，羅丹明6G(R6G)染料在聚合過程中被包裹在殼層內。調整染料的濃度可以準確控制微球的熒光強度，制備了12種不同熒光強度的熒光編碼微球。Liu等首先制備了烯丙基化的羅丹明B、熒光素和尼羅紅，然后將染料與苯乙烯單體等混合，通過分散聚合制備了3種熒光編碼微球，染料分子共聚在微球內部[28]。該課題組還利用吸附法制備了2種熒光編碼微球，微球分散良好，具有較高的熒光強度和穩定性。

Wu等通過有機溶膠-凝膠法，制備熒光編碼三聚氰胺-甲醛樹脂微球(見圖3)[29]。染料分子首先與樹枝狀的三聚氰胺-甲醛預聚物分子結合，在預聚物進一步反應生成微球的同時，將染料分子包裹在微球內部。該方法對多種染料都有很高的包裹率，微球具有較高的熱和機械穩定性，保存過程中幾乎無染料分子泄露。利用2種(每種染料5個濃度梯度)和3種染料(每種染料3個濃度梯度)，分別制備了25種和27種熒光編碼微球。利用染料間的熒光共振能量轉移作用，可以實現多種激發波長染料的單一波長激發。

圖3 有機溶膠-凝膠法制備熒光編碼微球[29]Fig.3 Schematic illustration of encoding microspheres prepared by the organic Sol-Gel doping mechanism[29]

3.5.2 量子點編碼

Vaidya等在懸浮聚合過程中，將量子點包裹在聚苯乙烯微球內部，調整量子點的顏色和數量，實現熒光編碼微球的制備[30]。激光共聚焦顯微鏡分析證明，量子點在微球內部呈多個團聚體分布，微球的發射光譜與非聚集態量子點相比沒有發生位移。由于團聚體內量子點間距離較近，不同發射波長量子點間發生共振能量轉移，改變了不同發射波長的相對熒光強度，不過這種能量轉移作用沒有改變編碼光譜的唯一性。利用一種染料作為內參比的比色式編碼，可以消除微球粒徑對編碼的影響。Yang等利用可聚合的表面活性劑作為乳化劑和相轉移劑，通過改進的細乳液聚合，將3-巰基丙酸修飾的CdTe量子點均勻包裹在聚苯乙烯微球內部[31]。聚苯乙烯具有致密結構和疏水特性，使得微球的熒光幾乎不受pH的影響。可聚合的表面活性劑與聚合物骨架之間的共價鍵，使量子點被牢固固定在微球內部，因此微球具有優異的抗溶劑特性。

Chan等以單分散二氧化硅微球為核，表面包裹摻雜量子點的二氧化硅殼層，實現熒光編碼微球的制備[32]。利用5-氨基-正戊醇(AP)和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，通過鏈交換作用取代量子點表面結合的TOPO，AP的羥基基團增加了量子點在乙醇中的分散性，APTMS則與二氧化硅基質反應生成硅氧鍵，將量子點牢固地固定在微球基質內。編碼微球的單分散性取決于內部的二氧化硅微球，因此不受編碼過程的影響。Graf等將聚乙烯吡咯烷酮修飾的量子點吸附到氨基功能化的二氧化硅微球表面，在微球表面包裹二氧化硅殼層，將量子點固定在微球內部[33]。

3.6 刺激響應性水凝膠

Kuang等利用N-異丙基丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶共聚物(PNIPVP)水凝膠的pH響應性，在酸性條件下將溶脹的凝膠微球與水溶性量子點孵育，微球經離心分離后分散在pH=7的水溶液中，凝膠網絡收縮將量子點包裹在微球內部(見圖4)；量子點在微球內均勻分布，將不同種類量子點按照不同比例包裹在凝膠微球內，可以獲得不同熒光編碼的凝膠微球[34]。該課題組還利用溫度響應性水凝膠微球制備量子點熒光編碼微球，特別是凝膠結構的溫度響應性使內部量子點之間的距離可以通過溫度進行調整，進而控制量子點之間共振能量的轉移，實現溫度響應性的熒光發射[35]。

圖4 pH響應性水凝膠負載量子點制備熒光編碼微球及pH響應性量子點釋放[34]Fig.4 Schematic illustration of the loading of quntum dots in spheres and their controlled release by pH[34]

3.7 膜乳化法

近紅外光與生物分子的作用較弱，因而背景干擾較小。然而，通常報道的近紅外量子點都具有較寬的發射光譜，因此當使用兩種或以上發射波長編碼時會出現光譜重疊現象。Wang等利用單波長編碼策略，解決光譜重疊的問題(見圖5)[36]。3種近紅外量子點的發射光譜均涵蓋流式細胞儀的FL4和FL5檢測通道，但是在兩個通道的強度比例不同，因而可以通過流式細胞儀進行區分。疏水性CdSeTe/CdS/ZnS量子點與聚合物分子溶解在甲苯中作為分散相，含有十二烷基磺酸鈉的水溶液作為連續相，分散相在氮氣壓力下通過Shirasu介孔膜生成水包油的液滴，甲苯從液滴中蒸發后聚合物固化生成微球，將量子點包裹在微球內部，得到高亮度的熒光編碼微球。量子點在整個微球內部均勻分布，微球具有較好的熒光穩定性和pH穩定性。3種量子點分別設置4個濃度梯度，制備得到了12種不同的熒光編碼微球。

圖5 單波長編碼制備熒光編碼微球[36]。(a)不同量子點編碼微球在FL4、FL5檢測通道內的分布比例不同；(b)3種量子點濃度梯度編碼微球；(c)編碼微球的流式細胞儀分析Fig.5 Microspheres encoded by “single wavelength” method.[36] (a) The relationship between the photoluminescence peak wavelength of microspheres and FL4, FL5 fluorescent detection channels of Beckman Coulter FC 500 flow cytometer；(b) Schematic of the relationship of the different barcodes corresponding to FL4 and FL5 fluorescence detection channels of flow cytometer；(c) Fluorescence barcodes matrices of encoding microspheres on flow cytometric FL5-FL4 plot diagram

3.8 微流控技術

微流控技術為納米材料的制備開辟了新的途徑[37]，在熒光編碼微球領域得到了廣泛的應用。Gerver等[38]利用全自動的微流控器件，制備了鑭系納米熒光材料編碼的親水性聚合物微球。鑭系納米熒光材料、聚乙二醇雙丙烯酸酯和光引發劑等溶解在甲醇中作為分散相，在流體通道內生成液滴，再經紫外線照射引發液滴內聚合反應，就得到熒光編碼微球。鑭系納米熒光材料由于Laporte限制的f-f能級階躍具有窄的發射峰，通用的主體基質使多種鑭系金屬可以通過同一波長進行激發，并且熒光穩定性好，無熒光重吸收現象。固定YVO4:Eu的濃度作為內參比，改變YVO4:Dy和YVO4:Sm的濃度，制備了24種不同的編碼微球，同種編碼微球之間編碼差別小于3%，不同編碼之間可以相互區分，誤差率小于1‰。

Fournier-Bidoz等利用濃度調節的流動聚焦微流控技術，制備量子點編碼熒光微球，含有量子點和苯乙烯-馬來酸酐共聚物的氯仿溶液在流體通道內生成液滴，氯仿擴散入水溶液后，聚合物固化生成熒光編碼微球。通過調整量子點的種類和濃度，制備了105種不同的熒光編碼微球。聚合物分子中的馬來酸酐遇水后水解生成兩個羧基，賦予微球表面負電荷，使微球穩定分散并方便后續生物探針的共價交聯。利用過濾器和閥門的組合，可以將反應產物中的水移除，使反應可以持續進行[39]。

Ji等利用微流控技術，制備量子點編碼的海藻酸鈣微球，含有量子點、海藻酸鈉的液滴與連續流動相中的鈣離子作用，生成包裹量子點的海藻酸鈣凝膠微球。利用金字塔狀的微流體網絡，可以實現量子點逐級濃度梯度的自動化，無需預先制備不同濃度和比率的量子點溶液，不同編碼的微球可以同時生成[40]。

Chen等利用毛細管微流控技術，制備水凝膠殼層保護的核-殼式熒光編碼微球，水凝膠殼層的保護避免了量子點的泄露，增加了熒光穩定性。利用多個內部分散相毛細管，制備含有多個內部液滴的油/水/油雙乳液為模板，不同種類量子點分散在不同的內部液滴中，液滴經紫外誘導聚合轉變為聚合物微球，制備得到結構不對稱的多核心熒光編碼微球。由于不同種類量子點相互之間沒有干擾，每種量子點的光譜可以被分別記錄，無需對不同顏色量子點的熒光進行區分和反褶積計算[41]。

熒光編碼微球的制備方法各自有其優勢和不足，如表1所示。

表1 熒光編碼微球制備方法對比Tab.1 Comparison of different preparation methods for fluorescence-encoded microspheres

4 與其他功能復合

4.1 熒光編碼-反射光譜編碼

利用熒光強度進行編碼的方式對微球粒徑的均一性和編碼過程的可控性具有非常高的要求，同時要求編碼微球具有較高的熒光穩定性。光子晶體反射編碼利用載體結構產生的獨特反射光譜進行編碼，編碼穩定性好[42-44]，不足之處在于反射峰的位置通常需要位于紫外-可見光區域，因此限制了編碼的容量。為了增加編碼容量，Li等通過層-層自組裝法，將CdTe量子點組裝在光子晶體編碼的二氧化硅膠體晶體微球(SCCBs)表面(見圖6)，實現熒光和光子晶體反射光譜的復合編碼[45-46]。由于兩種光譜的產生原理完全不同，因此兩種光譜編碼相互之間沒有干擾。編碼只依賴熒光發射峰和光子晶體反射峰的位置，不依賴熒光強度，因此編碼具有較高的穩定性。

圖6 熒光編碼-反射光譜復合編碼[45]Fig.6 Schematic illustration of encoding microspheres with combination of fluorescence and reflectance spectrum[45]

4.2 熒光編碼-熒光壽命編碼

同樣，為了克服熒光強度編碼的缺陷，Chen等利用晶格畸變和摻雜，制備近紅外熒光發射(700～910 nm)和長熒光壽命(約1 μs)的CdTe/CdS:Cu量子點，并利用量子點的多色發射和熒光壽命制備二維編碼微球[47]。

4.3 熒光編碼-前向散射編碼

Wang等利用膜乳化法制備包裹CdSe/CdS/ZnS量子點的熒光編碼微球，微球的粒徑可以通過Shirasu介孔膜的孔徑進行調節，不同粒徑的微球可以通過流式細胞儀的前向散射信號進行區分，實現熒光編碼和前向散射編碼的復合[48]。

4.4 磁性-熒光編碼微球

在懸浮芯片分析中，熒光編碼微球需要經過多次的分離和清洗操作，如果在熒光編碼的基礎上引入磁性功能，制備磁性-熒光編碼雙功能微球，通過外加磁場可以大大簡化微球的分離操作，降低分析過程的人力成本和時間成本。目前已有多篇磁性-熒光編碼微球的報道，如Li等利用有機溶劑溶脹和高溫溶脹法，依次將四氧化三鐵納米顆粒和量子點包裹在微球內部，制備磁性-熒光編碼微球[49]；Sathe等將疏水性量子點和四氧化三鐵納米顆粒通過疏水作用，組裝在介孔二氧化硅內部孔道內[50]；Wilson等[51-52]通過層-層自組裝法，將量子點組裝在商品化Dynal磁性微球表面，制備不同熒光編碼的磁性-熒光編碼微球；Insin等在二氧化硅微球表面同時包裹γ-Fe2O3納米顆粒和CdSe/CdZnS量子點，制備磁性-熒光編碼微球[53]；Li等在熒光編碼微球制備基礎上，通過在磁性微球表面包裹染料摻雜的三聚氰胺-甲醛樹脂殼層，得到核-殼式磁性-熒光編碼微球，在高溫煅燒除去熒光殼層的磁性微球表面重新包裹熒光殼層，實現磁性-熒光編碼微球的再生利用[54]；Wang等將含有量子點、磁性納米顆粒和聚苯乙烯-順丁烯二酸酐的甲苯溶液作為分散相，利用膜乳化法制備磁性-熒光編碼微球[55]；Zhao等利用毛細管微流控生成的油/水/油雙乳液液滴，制備量子點編碼顆粒，并通過流速和相組分的調節，制備內部含有獨立熒光編碼核和磁性核或者含有一個不對稱結構Janus核的磁性-熒光編碼微球[56]；Gao等將制備量子點熒光編碼微球的濃度調節流動聚焦技術擴展到磁性-熒光編碼微球的制備，并利用簡單的芯片設計，通過外加磁場實現檢測過程的自動化[57]。

5 總結與展望

懸浮芯片技術因具有多功能性、高靈活性等優勢，在生物醫學和分析領域得到廣泛的應用。作為懸浮芯片的分析載體，熒光編碼微球的制備研究取得了一系列進展，涌現了多種多樣的制備方法，包括有機溶劑溶脹法、層-層自組裝法、包埋法、微流控技術、膜乳化法等，并有多個商業化產品和配套檢測儀器可供用戶選擇。隨著納米技術的進一步發展，未來有望出現更多新型制備方法，進一步優化熒光編碼微球的制備和使用。

目前，限制熒光編碼容量的主要因素在于不同熒光發射光譜之間重疊，減少了可供選擇的編碼波長數量，同時增加了編碼和解碼的復雜性。為了提高編碼容量，一方面可以通過研發新型窄發射光譜的染料或熒光納米顆粒，增加編碼波長的可選擇數量，另一方面可以將熒光編碼與其他編碼方式復合，如之前提到的熒光編碼與反射光譜編碼、熒光編碼與熒光壽命編碼的復合等。需要注意的是，多種編碼方式復合在提高編碼容量的同時，可能會增加分析儀器的復雜性和檢測的耗時，因此不能單純地將多種編碼方式進行雜合。

未來生物分析技術的發展趨勢是集成化、自動化和高通量化，熒光編碼微球有望與微流控技術結合，將樣品混合、分離純化和檢測分析功能高度集成到一個微流控芯片上完成，實現檢測過程的自動化和通量化，降低分析檢測設備的復雜性和分析成本，有效促進即時檢測技術的進展和應用。

綜上所述，隨著納米技術的不斷發展、新型熒光材料合成和納米材料加工技術的不斷進步，將有望克服目前熒光編碼微球面臨的局限，提高熒光編碼微球的編碼容量和微球質量，簡化懸浮芯片分析設備復雜性，進一步擴展懸浮芯片技術在臨床診斷、藥物篩選、環境監測等領域的應用。

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Progress in the Preparation of Fluorescence-Encoded Microspheres

Li Yan1Luo Cheng1*Wu Daocheng2

1(SchoolofMedicine,YichunUniversity,Yichun336000,Jiangxi,China)2(KeyLaboratoryofBiomedicalInformationEngineeringofEducationMinistry,SchoolofLifeScienceandTechnology,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710049,China)

Suspension array is a promising platform for multiplex analyses with broad applications in science research and clinical diagnosis. As one of the key components for the suspension array, fluorescence-encoded microspheres have received much attention and a lot of achievements have been made. In this review, the analysis pattern and applications of suspension array were introduced, and recent advances in the fluorescence-encoded microspheres were summarized according to the classification of preparation methods including swelling method, layer-by-layer (LBL) self-assembly, embedding in microspheres, microfluidic techniques and membrane emulsification. Current challenges and future directions of fluorescence-encoded microspheres were also outlined.

suspension array; microspheres; fluorescence-encoding; quantum dots

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 02.013

2016-07-20， 錄用日期:2016-09-24

國家自然科學基金(81471771)；江西省自然科學基金(20161BAB215196)

R318

A

0258-8021(2017) 02-0219-09

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: luocheng999@163.com