2，3-二芳基-1，3-苯并噁嗪的合成及對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51活性的初步研究

唐子龍, 韓新亞, 李新興, 許志峰, 萬(wàn)義超

(1.湖南科技大學(xué) 理論有機(jī)化學(xué)與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 湘潭 411201;2.華中師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 武漢 430079; 3.衡陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 湖南 衡陽(yáng) 421002)

2，3-二芳基-1，3-苯并噁嗪的合成及對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51活性的初步研究

唐子龍1*, 韓新亞2, 李新興1, 許志峰3, 萬(wàn)義超1

(1.湖南科技大學(xué) 理論有機(jī)化學(xué)與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 湘潭 411201;2.華中師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 武漢 430079; 3.衡陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 湖南 衡陽(yáng) 421002)

首次對(duì)2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1，3-苯并噁嗪(1)與利什曼原蟲(chóng)CYP51的相互作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)化合物1對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，且作用方式類(lèi)似于底物與利什曼原蟲(chóng)CYP51的I型結(jié)合方式.該研究不僅發(fā)現(xiàn)了一種新型非唑類(lèi)針對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51的抑制劑：1，3-苯并噁嗪，而且也為創(chuàng)制新型作用方式的CYP51抑制劑研究提供了依據(jù).

2，3-二芳基-1，3-苯并噁嗪； 利什曼原蟲(chóng)； CYP51； 活性

1，3-苯并噁嗪衍生物是一類(lèi)重要的含氮雜環(huán)化合物，具有抗癌[1-3]、抗血小板聚集[4]、抗細(xì)菌和真菌[5-6]、抗結(jié)核病[7-8]、殺蟲(chóng)[9]等廣泛的生物活性[10-12].本課題組曾報(bào)道2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1，3-苯并噁嗪(1)具有良好的抑制水稻紋枯病菌的活性(100%，500 μg/mL)[13]，同時(shí)對(duì)蚜蟲(chóng)也具有一定的活性[14].這里將報(bào)道化合物1(見(jiàn)圖1)對(duì)利什曼原蟲(chóng)(Leishmania infantum)的殺蟲(chóng)活性.文獻(xiàn)對(duì)1，3-苯并噁嗪類(lèi)化合物的殺蟲(chóng)活性雖有報(bào)道[9，14]，但是相對(duì)較少，特別是對(duì)利什曼原蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性還未見(jiàn)報(bào)道.利什曼原蟲(chóng)是引起利什曼病的病原體.利什曼病的臨床特征主要表現(xiàn)為長(zhǎng)期不規(guī)則的發(fā)熱、脾臟腫大、貧血、消瘦、白細(xì)胞減少和血清球蛋白的增加，如不予合適治療，患者大都在病后1～2 a內(nèi)因并發(fā)其他疾病而死亡.本病多發(fā)于地中海國(guó)家及熱帶和亞熱帶地區(qū)，大約危及世界上90多個(gè)國(guó)家[15]，我國(guó)主要發(fā)生在新疆、甘肅、四川、陜西、山西和內(nèi)蒙古等地區(qū).至今，利什曼病幾乎沒(méi)有防治的疫苗，只有少量中等治療效果的藥物.CYP51(甾醇14α-去甲基化酶)是生物甾醇合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)其活性和功能受到抑制，就不能有效供給生物甾醇C-14α甲基羥基化所需氧原子，導(dǎo)致C-14α位去甲基化反應(yīng)受阻，生物甾醇合成減少或被完全阻斷，最后導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡[16-17].因此，利什曼原蟲(chóng)所含CYP51成了化學(xué)藥物治療利什曼病的潛在靶標(biāo)[15].所以，為了尋找殺利什曼原蟲(chóng)的高活性化合物，獲得治療利什曼病的高效藥物，本文研究了化合物1對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51的抑制活性以及二者的作用方式.

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of compound 1

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

NMR用Bruker Avance II-500 M核磁共振儀測(cè)定；紅外(IR)用PE-2000型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定；熔點(diǎn)用WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀測(cè)定(未校正)；元素分析用PE 2400 II元素分析儀測(cè)定；質(zhì)譜使用Thermo Finnigan LCQ質(zhì)譜儀測(cè)定；雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Perkin Elmer，UV-Lambda35/*)；分析天平(Sartorius，BT25S)；移液器(eppendorf)；分子對(duì)接采用Sybyl-X1.3軟件.磷酸鉀鹽緩沖液和所用試劑或溶劑均為分析純或化學(xué)純.

1.2化合物1的合成[13]

將2-((對(duì)甲苯基氨基)甲基)苯酚(1.07 g， 5 mmol)與鄰硝基苯甲醛(0.98 g， 6.5 mmol)溶于三氯甲烷與環(huán)己烷的混合溶液中 (100 mL，V/V=1/7 )并加入到250 mL圓底三頸燒瓶中，加入含有四氯化錫(0.26 g， 20%mol)的三氯甲烷溶液，安裝分水器，通入氮?dú)猓訜峄亓? h (TLC檢測(cè))，反應(yīng)完后，加三乙胺調(diào)節(jié)體系的pH值等于8，然后加入100 mL乙酸乙酯，分別用水(50 mL×2次)與氯化鈉飽和溶液(50 mL×2次) 洗滌有機(jī)相，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓脫溶得黃色油狀物，用乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶得黃色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率80%.m.p. 152.6～153.0 ℃.

1H NMR (CDCl3， 500MHz，δ): 2.25 (s， 3H， CH3)， 4.00 (d，J=17.0 Hz， 1H， CH2)， 4.19 (d，J=17.0 Hz， 1H， CH2)， 6.85 (s， 1H， CH)， 6.86～6.89 (m， 1H)， 7.00～7.06 (m， 6H)， 7.17～7.20 (m， 1H)， 7.44～7.47 (m， 2H)， 7.61～7.64 (m， 1H)， 7.71～7.74 (m， 1H);13C NMR (CDCl3， 125MHz，δ): 20.74， 47.12， 85.52， 116.72， 120.45， 120.86 (2C)， 121.13， 124.45， 126.72， 128.41， 128.76， 129.21， 129.80 (2C)， 131.84， 132.76， 132.99， 146.74， 149.08， 152.60; IR (KBr， ν): 3 083，3 021，2 972，2 920，1 610，1 585，1 530，1 513，1 486，1 456，1 437，1 386，1 363，1 337，1 292，1 276，1 268，1 224，1 198，1 144，1 109，1 034，1 024，1 015，978，961，935，852，839，820，782，757，736，714 cm-1; MS (ESI): 347 [M+H]+; Anal Calcd for C21H18N2O3: C 72.82; H 5.24; N 8.09. Found: C 73.11; H 5.26; N 8.05．

1.3化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51結(jié)合光譜實(shí)驗(yàn)[17]

稱(chēng)取適量質(zhì)量的化合物1，使用DMSO將其溶解配成0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L，2 mmol/L，5 mmol/L濃度梯度的化合物1儲(chǔ)液備用.使用磷酸鉀緩沖液將利什曼原蟲(chóng)CYP51稀釋到2 μmol/L，并將其分別加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的石英比色皿中進(jìn)行基線(xiàn)校準(zhǔn).然后使用移液器，每次加入1 μL適當(dāng)濃度的化合物1，常溫反應(yīng)3 min后掃描記錄光譜吸收，重復(fù)上述操作直至隨著化合物1的加入吸收光譜沒(méi)有明顯變化為止.結(jié)合常數(shù)Kd由Ifree(自由化合物濃度)與ΔA(吸光度差值)擬合得到的logistic回歸方程求出，[Ifree]=[Itotal]-E×ΔA/ΔAmax；其中，[I]和[E]是滴定體系中的化合物1的濃度和利什曼原蟲(chóng)CYP51的濃度，ΔA是給定化合物濃度下光譜波峰與波谷吸收值之間的差值，ΔAmax是飽和狀態(tài)下的ΔA.

1.4化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51分子對(duì)接[15]

選擇利什曼原蟲(chóng)CYP51的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3L4D)為模板，在Sybyl-X1.3中對(duì)其進(jìn)行加氫處理.使用Sybyl-X1.3構(gòu)建化合物1并對(duì)其進(jìn)行力場(chǎng)和電荷優(yōu)化，使用Surflex-Dock模塊將化合物1對(duì)接到利什曼原蟲(chóng)CYP51的晶體結(jié)構(gòu)中，綜合考慮化合物1和利什曼原蟲(chóng)CYP51的結(jié)構(gòu)信息以及對(duì)接打分，選擇出化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51可能的結(jié)合方式.

2結(jié)果與討論

2.1化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51結(jié)合光譜

[17]，以藥物酮康唑(CYP51抑制劑)為對(duì)照樣品，考察了化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51的結(jié)合能力.結(jié)合光譜實(shí)驗(yàn)表明，隨著滴定濃度的增加，化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51呈現(xiàn)明顯的結(jié)合，表現(xiàn)在約394 nm處有波峰，430 nm處出現(xiàn)波谷，是細(xì)胞色素P450的典型I型結(jié)合光譜(圖2).可能的原因是化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51的結(jié)合使得卟啉環(huán)中的鐵原子由原來(lái)的6配位變成了5配位的高自旋狀態(tài)，最高吸收峰藍(lán)移形成I型結(jié)合光譜.這種類(lèi)似于底物與利什曼原蟲(chóng)CYP51的I型結(jié)合光譜，既為發(fā)現(xiàn)新型作用方式的CYP51抑制劑提供了參考，也將為非唑類(lèi)CYP51抑制劑的研發(fā)提供依據(jù).目前，使用的唑類(lèi)藥物多為CYP51抑制劑，它們與CYP51的結(jié)合光譜通常表現(xiàn)為II型結(jié)合，而且由于唑類(lèi)藥物的長(zhǎng)期使用，已有不少藥物產(chǎn)生抗性[18].解決這一問(wèn)題的方法之一，就是創(chuàng)制具有新型作用方式的CYP51抑制劑或非唑類(lèi)CYP51抑制劑.

圖2 化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51結(jié)合光譜Fig.2 Difference spectra obtained with compound 1 and L. infantum CYP51

為了具體評(píng)價(jià)化合物1的結(jié)合能力，測(cè)定了化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51的結(jié)合常數(shù)Kd.如圖3所示，以反應(yīng)體系中游離化合物1的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度差值ΔA為縱坐標(biāo)，擬合得到化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51的結(jié)合常數(shù)Kd=7.7±1.4 μM，表明化合物1具有較強(qiáng)的結(jié)合能力(酮康唑：Kd=0.05±0.002μM).

圖3 化合物1飽和滴定曲線(xiàn)(X軸代表自由化合物1濃度(Ifree)，Y軸代表吸光度差值ΔA)Fig.3 Compound 1 binding saturation curve(The X-axis represents the concentration of the unbound compound 1 (Ifree); the Y-axis represents absorbance difference ΔA)

2.2化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51結(jié)合方式

為了探究化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51可能的結(jié)合方式，將化合物1對(duì)接到利什曼原蟲(chóng)CYP51的活性空腔內(nèi)[15]，綜合考慮打分以及化合物1和利什曼原蟲(chóng)CYP51活性空腔結(jié)構(gòu)信息，選擇了如圖4所示的化合物1與利什曼原蟲(chóng)CYP51的結(jié)合構(gòu)象.從這個(gè)構(gòu)象中可以看出，利什曼原蟲(chóng)CYP51的活性空腔是較為疏水的，化合物1中帶硝基的苯環(huán)與V460、L355有疏水相互作用；帶甲基的苯環(huán)伸向了F109、A286、F104和F289形成的疏水口袋；苯并噁嗪環(huán)所含苯基與F289形成π-π相互作用.

圖4 化合物1與L. infantum CYP51可能的結(jié)合模式圖Fig.4 Possible complex of compound 1 and L. infantum CYP51

3結(jié)論

合成了2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1，3-苯并噁嗪1.初步研究了化合物1對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51的抑制活性，結(jié)果表明化合物1不僅對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力，且為類(lèi)似于底物與利什曼原蟲(chóng)CYP51的I型結(jié)合方式，因此該研究不僅發(fā)現(xiàn)了一種新型非唑類(lèi)針對(duì)利什曼原蟲(chóng)CYP51的抑制劑：1，3-苯并噁嗪，也為發(fā)現(xiàn)新型作用方式的CYP51抑制劑研究提供了參考.

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Synthesis of 2,3-diaryl-1,3-benzoxazine and preliminarystudies on its activity againstLeishmaniainfantumCYP51

TANG Zilong1, HAN Xinya2, LI Xinxing1, XU Zhifeng3, WANG Yichao1

(1.Key Laboratory of Theoretical Organic Chemistry and Functional Molecule of Ministry of Education,Hunan University of Science and Technology, Xiangtan, Hunan 411201;2. School of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan 430079;3.School of Chemistry and Material Science, Hengyang Normal University, Hengyang, Hunan 421002)

The interaction of 2-(2-nitrophenyl)-3-(4-methylphenyl)-1,3-benzoxazine (1) andLeishmaniainfantumCYP51 was preliminarily investigated for the first time. The results indicated that compound 1 exhibited relatively strong inhibitory activity with I type mode of action similar to the model between the substrate andLeishmaniainfantumCYP51. The study has not only discovered a new kind of non-azole inhibitor (1,3-benzoxazine) againstLeishmaniainfantumCYP51, but also provided experimental basis for the discovery of new CYP51 inhibitory with new mode of action.

2,3-diaryl-1,3-benzoxazine;Leishmaniainfantum; CYP51; activity

2016-09-28.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21372070)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題(2011BAE06B01)；理論有機(jī)化學(xué)與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(LKF1402).

1000-1190(2017)01-0052-04

O626

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: zltang67@aliyun.com.