EGFR、KRAS、ALK在肺腺癌中表達的意義

劉麗波，苗 帥，韓志峰，薛錦儒，辛 華，楊 斌*

(1.吉林大學第四醫(yī)院 腫瘤內科，吉林 長春130011；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.老年病科;b.胸外科)

EGFR、KRAS、ALK在肺腺癌中表達的意義

劉麗波1，苗 帥2a，韓志峰2b，薛錦儒2b，辛 華2b，楊 斌2b*

(1.吉林大學第四醫(yī)院 腫瘤內科，吉林 長春130011；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.老年病科;b.胸外科)

間變淋巴細胞瘤激酶(ALK)融合基因是最新的非小細胞肺癌(NSCLC)治療靶點，最初于2007年被發(fā)現(xiàn)并描述[1]，這種融合來源于2號染色體短臂的內轉位，棘皮動物微管相關類蛋白4(EML4)融合于間變淋巴細胞瘤激酶(ALK)胞內激酶域，導致了異常的蛋白激酶表達。它在體內及體外都具有潛在的致癌活性[2，3]，針對這一靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑克里唑替尼(Crizotinib)可以有效的阻止其致癌活性，I期及II期的臨床試驗證實其有效率達55-70%[4]。但鑒于ALK融合基因發(fā)生的陽性率較低，采用FISH方法作為篩選手段價格昂貴，因此如何準確、快速地在臨床上篩選出ALK融合基因陽性的患者顯得至關重要。本研究根據(jù)EML4-ALK融合基因的臨床病理特點，選擇肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙的患者為研究對象，設計了一個新的臨床檢測路線，使得EML4-ALK融合基因檢測陽性率明顯提高，為普及開展EML4-ALK融合基因檢測提供了一個思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院及吉林大學第四醫(yī)院2013-2015年手術切除和經(jīng)皮肺穿刺活檢病理確診的96例肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者石蠟包埋組織。年齡32-77歲，平均年齡59歲；男性23例(24.0%)，女性73例(76.0%)。所有病例術前均未行化療、放療或靶向治療。按2009 國際肺癌研究學會( IASLC) 公布的第7 版肺癌TNM 分期標準:Ⅰ期6例，Ⅱ期12 例，Ⅲ期65 例，Ⅳ期13例。另選取2013-2015年吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院非小細胞肺癌56例作為ALK檢測對照，年齡46-73歲，平均年齡55歲；男性34例(60.7%)，女性22例(39.3%)。其中腺癌34例、鱗癌20例，其它2例。

1.2 方法 (1) 用ARMS方法檢測肺癌組織中EGFR、KRAS基因突變:檢測樣本HE 切片經(jīng)由病理科醫(yī)生選擇基因檢測的腫瘤區(qū)域切取石蠟切片。按說明書提取DNA。EGFR、KRAS基因突變檢測:采用武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司研發(fā)的人類EGFR、KRAS基因突變檢測試劑盒( 熒光PCR法) (ARMS)，檢測EGFR基因18-21 外顯子29種突變，KRAS基因12和13密碼子上7種突變，按試劑盒說明書進行操作。(2)FISH 方法檢測EML4-ALK 融合基因:FISH 試劑盒由雅培分子公司提供，F(xiàn)ISH DNA 探針:Vysis 公司的LSI ALK 的雙色分離重排探針20 μl，具體實驗步驟按說明書進行。結果判斷標準:計數(shù)100 個完整細胞，其中異常細胞數(shù)> 15%則為陽性。異常細胞分兩種情況:①單橙與單綠信號距離重疊且重疊數(shù)≥1，另有單橙信號出現(xiàn);②單橙與單綠信號距離>2。

1.3 檢測順序 首先檢測EGFR突變。排除EGFR突變檢測陽性標本后，剩余標本(即EGFR突變野生型標本)第二步進行K-Ras突變檢測。排除K-Ras突變檢測陽性標本后，剩余標本(即EGFR突變及K-Ras突變雙陰性標本)第三步再進行EML4-ALK融合基因突變檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，EGFR基因突變、K-Ras突變和EML4-ALK融合基因各組間表達水平與各臨床病理參數(shù)之間的比較采用χ2檢驗、連續(xù)校正χ2檢驗或Fisher 精確概率。EML4 -ALK檢測實驗組與對照組之間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EGFR基因突變狀況及與臨床特征的關系 96例患者中，39例(40.6%)患者攜帶EGFR突變，EGFR野生型57例(59.4% )。見表1。 統(tǒng)計學分析顯示，EGFR突變患者與野生型患者年齡無差異(中位年齡:57歲vs.57.5歲，P=0.958。女性患者EGFR突變率顯著高于男性(34/73,46.6% ;5/23,21.7%,P<0.05)。不同分期患者EGFR突變率無差異(P=0.187)。

表1 EGFR突變情況

2.2 KRAS基因突變與臨床特征的關系 57例EGFR突變野生型患者20例(35.1%)攜帶KRAS突變，其中12密碼子突變17例，13密碼子突變3例。KRAS突變患者與野生型患者年齡無差異(59歲vs 57歲，P=0.348)，男性和女性KRAS突變率無差異(8/18,44.4%；12/39,30.8%,P=0.315)，不同分期患者間KRAS突變率無差異(P=1.000)。

2.3 EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者EML4-ALK融合基因檢測結果 37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽性(21.6%，8/37)。統(tǒng)計分析顯示，ALK陽性患者與ALK陰性患者年齡無差異(52.5歲vs.58歲，P=0.083)。男性和女性患者中ALK陽性率無差異(2/10,20.0%;6/27,22.2%,P=1.000)。不同分期患者ALK陽性率也未見差異(P=1.000)。8例FISH陽性腫瘤中，6例(75.0%)為紅綠分離信號，2例(25.0%)為單紅信號。

2.4 EGFR，KRAS，EML4-ALK在特定人群中分布比例 對96例肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者進行了EML4-ALK,EGFR,KRAS的檢測，發(fā)現(xiàn)在中國肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR (39/96,43.3%),KRAS (20/96,20.8% ),EML4-ALK (8/96,8.3% )。總的來說，約69.7%的中國肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者存在以上三種基因的突變。

2.5 EML4-ALK融合基因檢測對照組結果 56例非小細胞肺癌患者，2例(3.6%，2/56)ALK陽性，均為腺癌患者。2例FISH陽性腫瘤中均為紅綠分離信號。

2.6 EML4-ALK融合基因檢測實驗組與對照組的陽性率比較 實驗組(21.6%，8/37)與對照組(3.6%，2/56) ALK陽性率統(tǒng)計分析，差異具有顯著性(P<0.05)。

3 討論

個體化治療及精準醫(yī)學的飛速發(fā)展極大地改善了晚期非小細胞肺癌患者的預后，尤其是具有明確驅動基因的患者[5]。EGFR基因突變、K-Ras突變和EML4-ALK融合基因是肺癌尤其是NSCLC中最為常見突變類型，并已成為肺癌分子靶向治療中的重要靶點。EGFR突變檢測及其EGFR-TKI的使用是非小細胞肺癌治療史上里程碑式的進展。繼EGFR之后，ALK重排也己成為非小細胞肺癌尤其是肺腺癌中一個非常重要的分子亞型[6]。但由于ALK融合基因發(fā)生的陽性率較低，如何準確、快速的在臨床上篩選出ALK融合基因陽性的患者顯得至關重要。隨著有關分子標志物及其在NSCLC中預后和治療價值的認識的發(fā)展，將對更普遍的分子標志物進行檢測整合進我們日常的臨床工作中是十分必要的。Horn和Pao[7]建議基于基因突變在NSCLC中的普遍性及意義，序貫性的檢測KRAS，EGFR和EML4-ALK融合基因突變。因為沒有數(shù)據(jù)支持在初始檢測中只檢測KRAS或EGFR突變，國外還有學者[8]建議同時進行KRAS和EGFR檢測。雙陰性患者再進行ALK重排檢測。

因為東亞人群與西方高加索人群存在基因突變的差異[9]，東亞患者的K-Ras突變沒有高加索人群所占比例高[10-14]，而且K-Ras突變在實際的臨床工作中的意義沒有EGFR突變的意義大，首先檢測K-Ras突變陰性的患者還要檢測EGFR突變檢測，延遲了患者的治療，同時限于標本量有限，經(jīng)過多次取材后會對以后的結果產生影響。并且由于K-Ras突變與EGFR突變兩者是互斥的，也沒有必要初始同時進行兩種突變的檢測。本研究建議首先檢測EGFR突變，如果為陽性，則可以直接進行EGFR-TKI靶向治療。如果為陰性再進行K-Ras突變檢測，因為K-Ras突變發(fā)生率明顯高于EML4-ALK融合基因突變，且兩者互斥，可以將K-Ras突變檢測作為另一種排除手段，這樣又可以排除掉一部分病例。如果K-Ras突變?yōu)殛幮栽龠M行EML4-ALK融合基因突變檢測[15]，這樣在排除大部分病例的情況下就可以大大提高其檢出陽性率，在標本量有限，節(jié)約檢查成本的前提下篩查出這部分患者，為靶向治療做準備。

本研究中，對96例肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者進行了EML4-ALK,EGFR,KRAS的檢測，39例(40.6%)患者攜帶EGFR突變，EGFR野生型57例(59.4% )。女性患者EGFR突變率顯著高于男性(34/73,46.6% ;5/23,21.7%,P<0.05)。57例EGFR突變野生型患者20例(35.1%)攜帶KRAS突變，其中12密碼子突變17例，13密碼子突變3例，各臨床特征之間無差異。37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽性(21.6%，8/37)，ALK陽性患者與ALK陰性患者年齡無差異(52.5歲vs.58歲，P=0.083)。在中國肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR (39/96,43.3%),KRAS (20/96,20.8% ),EML4-ALK (8/96,8.3%)。總的來說，約69.7%的中國肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者存在以上三種基因的突變。

37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者采用了FISH法檢測其ALK基因的重排狀態(tài)，8例(8.3%) ALK陽性。56例非小細胞肺癌患者作為檢測對照組，2例(3.6%) ALK陽性。兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明這種檢測流程能夠明顯提高檢出的陽性率。

通過本研究我們獲得了在我國特定的人群中(肺腺癌、不吸煙或輕度吸煙患者)EGFR,KRAS，EML4-ALK的分布情況，同時采用特定的檢測流程可以明顯提高EML4-ALK融合基因檢出的陽性率，節(jié)約了成本，提高了效率，能夠在臨床實際應用中得到推廣，為在我國普及開展EML4-ALK融合基因檢測提供了一個思路，為進一步開展克里唑替尼靶向治療提供了技術支持與基礎。

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吉林省衛(wèi)生計生委(2014ZC045)；吉林大學橫向課題吳階平基金會(3D513T073430)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0840-03

2016-09-25)