非酒精性脂肪肝病動物模型的探討

李曉波 李燕(通訊作者)

650031昆明理工大學附屬昆華醫院干部保健科

非酒精性脂肪肝病動物模型的探討

李曉波 李燕(通訊作者)

650031昆明理工大學附屬昆華醫院干部保健科

目的：探討非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型的建立。方法：選擇雄性SD大鼠40只，平均分為對照組和實驗組，實驗高脂灌胃12周后，分別處死大鼠各半，肝臟組織切片HE染色，測定肝功、血脂，稱取大鼠體重及肝臟重量，進行統計學處理分析。結果：高脂飲食可以成功建立大鼠NAFLD模型。結論：高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，簡單易行，成本低，方便臨床進行NAFLD發病機制、藥物干預的研究。

非酒精性脂肪肝病；動物模型；高脂飲食

非酒精性脂肪肝病是一種臨床較為常見的肝臟疾病，主要指患者無大量飲酒史，但在對肝臟進行檢查時顯示肝臟出現脂肪變性的特征。除脂肪變性的特點外，患者還常伴有肝細胞損傷、肝癌甚至肝功能衰竭等[1]。臨床上根據肝臟損傷的程度，把NAFLD分為單純性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及脂肪堆積引起的相關肝硬化等。NAFLD發病率呈上升趨勢，中國城市發病率約30%[2]，對人們的健康和生活產生嚴重的影響。NAFLD的發病機制、治療已成為研究熱點。肝組織活檢可判定NAFLD病理學改變，為診斷及判定NAFLD病情的金標準。但NAFLD的肝臟組織病理學診斷在人體難以實現，且藥物干預后人體肝臟病理學變化難以進行觀察，選擇一種簡單易行、穩定的動物模型極為重要。目前國內外常用的NAFLD動物模型有很多種，但是，其中最為理想的動物模型必須有下面這些特點：①在動物模型中建立的疾病，其特征必須與人類所患疾病的特征相似；②該病變有一定的發生和發展過程；③動物模型易于建立，在建立模型的過程中動物的死亡率低，并且重復性好。本研究對高脂灌胃構建NAFLD大鼠模型方法進行探討，現報告如下。

資料與方法

實驗動物：雄性SD大鼠40只，由昆明醫科大學動物實驗中心提供，體重160～180 g。基礎飼料配方為每1 000 kg飼料含玉米粉440 kg，豆餅170 kg，大米粉150 kg，魚粉100 kg，麥麩100 kg，酵母粉20 kg，骨粉10 kg，食用鹽10 kg，分為對照組和實驗組，各20只。

高脂溶液的配制和灌胃：97%的豬油+2%的膽固醇+1%的膽酸鈉配成100%的高脂溶液，實驗組大鼠灌胃量為1 g高脂溶液/100 g大鼠體重。每天早7：00-9：00灌胃，12周后隨機選取兩組各10只(造模期間有2只大鼠死亡)，處死大鼠，收集血清、肝臟組織檢測相應指標；肝臟HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學改變。檢驗NAFLD模型是否成功。

統計學方法：采用SPSS 19.0分析，計量資料采用(±s)表示，采用t檢驗，計數資料使用(%)表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

肝臟切片HE染色：在本研究中，動物模型建立完成后，分別對兩組大鼠的肝臟進行切片HE染色觀察，在對照組，其切片HE染色后發現肝臟細胞沒有任何炎性反應和脂肪顆粒沉積；而在灌胃組，每個大鼠的肝臟組織均存在一定程度的脂肪浸潤和炎性反應，嚴重者已經達到了重度脂肪肝水平，見圖1。

肝功能：兩組肝功能指標比較，實驗組大鼠AST、ALT以及AKP明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

血脂：實驗組CHOL、TG以及LDL明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

大鼠肝重與體重比：實驗組和對照組相比，肝臟重量與大鼠體重的百分比明顯升高，差異有統計學意義(P＜ 0.05)，見圖2。

圖1 灌胃12周后大鼠肝臟切片HE染色(A與C是實驗組大鼠，B與D是對照組大鼠)(20×20)

表1 灌胃12周后大鼠肝功能比較(±s，U/L)

表1 灌胃12周后大鼠肝功能比較(±s，U/L)

注：與空白對照組相比，?P＜0.05。

項目 對照組 實驗組天門冬氨酸氨基轉移酶(AST) 233±44.7 537±232.6?丙氨酸氨基轉移酶(ALT) 68±12.96 123±40.37?堿性磷酸酶(AKP) 47±6.844 155±44.82?

表2 灌胃12周后大鼠血脂指標比較(±s，g/L)

表2 灌胃12周后大鼠血脂指標比較(±s，g/L)

注：與對照組相比，?P＜0.05。

項目 空白組 實驗組總膽固醇(CHOL) 1.13±0.16 1.63±0.35?甘油三酯(TG) 0.16±0.04 0.27±0.09?高密度脂蛋白膽固醇(HDL) 0.5±0.11 0.44±0.06低密度脂蛋白膽固醇(LDL) 0.33±0.09 0.58±0.12?

討論

目前國內外常用的NAFLD動物模型可分為4類：①基因改良模型；②食物、藥物、毒物誘導模型；③基因飲食復合模型；④中醫模型。常用模型動物有大鼠、小鼠、家兔等。其中基因模型成本高；藥物及毒物誘導模型在發病機制、演變過程及組織病理形態等方面與人類脂肪肝差異大，且藥物毒性強，死亡率高；復合模型沒有統一的建模標準；中醫模型難度大[3]。而高脂飲食模型在病因、病理等方面與人類NAFLD發病機制最為相似。高脂飲食模型具有肥胖、高脂血癥等代謝綜合征表現，鏡下可見大細胞性脂肪變性、氣球樣變性等[4]。

本次研究采用高脂飲食灌胃的方法，成功構建了NAFLD大鼠模型：①肝臟切片HE染色：在本研究中，動物模型建立完成后，分別對兩組大鼠的肝臟進行切片HE染色觀察。在對照組，其切片HE染色后發現肝臟細胞沒有任何炎性反應和脂肪顆粒沉積，而在實驗組，每個大鼠的肝臟組織均存在一定程度的脂肪浸潤和炎性反應，嚴重者已經達到了重度脂肪肝水平；②實驗組CHOL、TG以及LDL明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；③實驗組與對照組相比，肝臟重量與大鼠體重的百分比明顯升高，這可能與肝臟中的脂質沉積有關。本研究的高脂溶液中加入少量膽酸鹽，可增加外源性膽固醇的吸收[5]。

圖2 大鼠處死時肝臟占體重百分比注：實驗組與對照組相比，P＜0.05。

綜上所述，高脂飲食建立NAFLD大鼠模型簡單易行，成本低，方便臨床進行NAFLD發病機制、藥物干預的研究。

[1]Verbeek J,Cassiman D,Lannoo M,et al.Treatment of non-alcoholic fatty liver disease：can we already face the epidemic?[J].Acta Gastroenterol Belg,2013,76(2)：200-209.

[2]Liu JJ,Chen YY,Mo ZN,et al.Relationship between Serum Osteocalcin Levelsand Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in Adult Males,South China[J].Int J Mol Sci,2013,14 (10)：19782-19791.

[3]黃海燕,辛永寧,姜曼,等.非酒精性脂肪性肝病動物實驗模型研究進展[J].臨床肝膽病雜志,2014,30(9)：948-953.

[4]REDDYSK,ZHAN M,ALEXANDER HR,et al.Nonalcoholic Fatty Liver Disease is associated with benign gastrointestinal disorders [J].World J Gastroenterol,2013,19(45)：8301-8311.

[5]Vergnes L,Phan J,Strauss M.Cholestero1 and cho1ate components of an atherogenic diet induce distinct stages of hepatic inflammatorv gene expression[J].J Biol Chem,2003, 278：42774-42784.

Discussion on nonalcoholic fatty liver disease animal model

Li Xiaobo,Li Yan(Corresponding author)
Health Care For Cadres,Kunhua Hospital Affiliated to Kunming University of Science and Technology 650031

Objective：To explore the establishment of nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)rat model.Methods：40 male SD rats were selected.They were divided into the blank control group(CON)and the high-fat diet group(HFD).After 12 weeks of high fat feeding,half of the rats were executed.Liver tissue was given HE staining.We measured the liver function and blood lipids.The weight and liver weight of rats were measured.We performed statistical analysis of all the data.Results：High fat diet can successfully establish rat NAFLD model.Conclusion：The establishment of NAFLD rat model with high fat diet was simple and easy,and the cost was low.It was convenient to study the pathogenesis and drug intervention of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease;Animal model;High fat diet

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.10.1

云南省科技廳-昆明醫科大學聯合專項(2011FB225)

Fund projectJoint special of Yunnan science and technology department-Kunming Medical University(2011FB225)