金雙歧對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織細胞因子表達的影響①

曲博新，顏 玉，張瑞洲，張芮瑞，薛 琳，孫培茹

(1.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

金雙歧對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織細胞因子表達的影響①

曲博新1，顏 玉1，張瑞洲1，張芮瑞1，薛 琳2，孫培茹2

(1.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察金雙歧對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織細胞因子表達情況。方法：將雄性Wistar大鼠30只隨機分為5組：①對照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯合治療組，每組6只。①對照組和②模型組：均灌腸生理鹽水1mL·kg-1，③惠迪組：惠迪溶液2mL0.5g/kg·d灌胃1次。④金雙歧組，金雙歧溶液2mL7.5g/kg/d灌胃1次。⑤惠迪和金雙歧聯合治療組：用莎爾福溶液2mL5g/kg·d和金雙歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1 次。給藥第14天大鼠處死，剪下病變最明顯結腸組織，吸干血跡稱取15g加0.9%氯化鈉研磨制漿，全自動脫帽離心機DD4-T3000r·min-1離心15min，取上清液-20℃保藏，IL-4，TNF-α運用RIA法測定。結果：惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯合用藥3個治療潰瘍性結腸炎大鼠TNF-α含量顯著降低，而IL-4含量顯著升高。結論：惠迪、金雙歧對潰瘍性結腸炎治療均有效，聯合用藥效果更佳。

金雙歧；潰瘍性結腸炎大鼠；結腸組織；細胞因子；表達

1875年首先由Moxon和Willks描述潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)，1903年Boas和Willks將其命名為潰瘍性結腸炎，1973年世界衛生組織(WHO)醫學科學國際組織委員會正式命名為慢性非特異性潰瘍性結腸炎又稱潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)。潰瘍性結腸炎病因目前尚未完全闡明，潰瘍性結腸炎主要侵潤結腸黏膜慢性非特異性炎性疾病，大多是開始于左半邊結腸，然后向結腸近端乃至于全結腸連續不斷逐漸進展[1]。潰瘍性結腸炎結腸上皮產生抗原激活免疫淋巴細胞和巨噬細胞釋放出多種細胞因子和血管活性物質，促進并加重結腸組織炎癥反應，潰瘍性結腸炎檢測相關細胞因子水平和變化可作潰瘍性結腸炎發生程度指標。本研究通過金雙歧治療潰瘍性結腸炎大鼠模型檢測結腸病理組織學及細胞因子變化，探索金雙歧治療潰瘍性結腸炎依據，為臨床探索輔助方法治療潰瘍性結腸炎。

1 材料與方法

1.1 動物及藥物

雄性Wistar大鼠30只，體重(100±20)g，由佳木斯大學實驗動物中心提供。金雙歧(雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片)(內蒙古雙奇藥業股份有限公司)；惠迪(美沙拉秦腸溶片)(佳木斯鹿靈制藥有限責任公司)。

1.2 主要試劑和儀器

2，4-二硝基氯苯(DNCB)(上海安諾芳胺化學品有限公司)，分析純丙酮(山東禹王實業有限公司化工分公司)，無水乙醇(濟南世紀通達化工有限公司)，36%醋酸(南京化學試劑股份有限公司)，0.9%氯化鈉注射液(沈陽恒之盛商貿有限公司)，硫化鈉(南陽同泰化工有限公司)。

免疫組化試劑盒(上海撫生實業有限公司)，Countstar自動細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司)，全自動脫帽離心機DD4-T(長沙湘銳離心機有限公司)，BXP-124高檔研究型雙目生物顯微鏡(上海荼明光學儀器有限公司)。

1.3 2，4 二硝基氯苯(DNCB)+醋酸聯合建潰瘍性結腸炎大鼠造模及鑒定方法

1.3.1 造模方法。首先用100g/L硫化鈉將雄性Wistar大鼠頸部背面毛脫去，去毛后頸部背面連續14d滴1次/d5滴(0.25mL)20g/L2，4-二硝基氯苯(DNCB)丙酮液，第15天用3mm直徑導尿管經過肛門插入結腸8cm處，注入0.25mL0.1%DNCB乙醇溶液，第15天同部位注入2mL8%醋酸溶液，10s后用5mL0.9%氯化鈉溶液沖洗。飼養14d每天連續觀察大鼠大便性狀、飲食、毛發和活動狀態等[3]。

1.3.2 模型鑒定。潰瘍性結腸炎大鼠造模30d后，采用病理學病理學檢查可觀察到結腸出現水腫、充血、炎細胞浸潤、隱窩膿腫、杯狀細胞減少、腺體破壞及小潰瘍形成等一系列變化，可以確認潰瘍性結腸炎大鼠造模成功[4]。

1.4 大鼠分組、給藥及取材

將雄性Wistar大鼠30只隨機分為5組：①對照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯合治療組，每組6只。①對照組和②模型組：均灌腸生理鹽水1mL·kg-1，③惠迪組：惠迪溶液2mL0.5g/kg·d灌胃1次。④金雙歧組，金雙歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1次。⑤惠迪和金雙歧聯合治療組：用莎爾福溶液2mL5g/kg·d和金雙歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1 次。給藥第14天大鼠處死，剪下病變最明顯結腸組織，吸干血跡稱取15g加0.9%氯化鈉研磨制漿，全自動脫帽離心機DD4-T3000r·min-1離心15min，取上清液-20℃保藏，IL-4，TNF-α運用RIA法測定[5]。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 金雙歧等五處理大鼠一般狀況表現

①對照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯合治療組處理大鼠狀況表現見表1。

表1 金雙歧等五處理大鼠一般狀況表現

2.2 金雙歧等五處理大鼠結腸黏膜病理學檢查2.2.1 結腸黏膜炎細胞浸潤評分標準

潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜炎細胞浸潤評分標準見表2。

2.2．2 結腸黏膜炎細胞浸潤深度評分標準

潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜炎細胞浸潤深度評分標準見表3。

表2 結腸黏膜炎細胞浸潤評分標準

表3 結腸黏膜炎細胞浸潤深度評分標準

2.2.3 金雙歧等五處理對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜損傷的影響

①對照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯合治療組五處理對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜損傷表現情況：①對照組大鼠在活動能力、飲食量、體重、排便均正常；②模型組大鼠精神萎靡、飲食量減少、體重下降，出現溏、血便，結腸組織出現炎細胞浸潤深至全層，潰瘍面比較大，深度達黏膜肌層；③惠迪組大鼠活動能力逐漸好轉、飲食量漸增、體重稍有恢復、溏、血便稍有緩解，結腸組織炎細胞浸潤緩解，潰瘍稍小，深度沒有達黏膜肌層；④金雙歧組大鼠活動狀況好轉、飲食量增加、體重恢復、溏、血便改善，結腸組織炎細胞浸潤明顯緩解，潰瘍小，深度達黏膜層；⑤惠迪和金雙歧聯合治療組大鼠活動緩解、飲食量和體重正常、溏血便明顯緩解，結腸組織潰瘍和腺體增生基本愈合，但有明顯愈合面存在。金雙歧等五處理對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜損傷的影響見表4。

表4 金雙歧等五處理對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜損傷影響±s，n=6)

注：與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，abP<0. 05，cP<0.01。

2.3金雙歧等五處理大鼠血清IL-4與TNF-α水平變化

金雙歧、對照、模型、莎爾福、莎爾福和金雙歧聯合用藥處理大鼠結腸黏膜IL-4與TNF-α水平變化，見表5。

表5 金雙歧等五處理大鼠結腸黏膜大鼠IL-4 及TNF-α水平變化

注：與對照組比較△P﹤0.05；與模型組比較☆P﹤0.05。

金雙歧、對照、模型、莎爾福、莎爾福和金雙歧聯合用藥處理大鼠結腸黏膜IL-4與TNF-α水平變化結果可以看出：①惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯合用藥3個治療組IL-4、TNF-α表達均低于模型組，表現顯著差異性(P<0.05)，說明金雙歧、惠迪、惠迪和金雙歧聯合用藥IL-4和TNF-α表達均有效降低。②惠迪組與金雙歧組和金雙歧和惠迪福聯合用藥組相比差異性顯著(P<0.05)，與對照組相比表現差異不顯著(P>0.05)，說明莎爾福和金雙歧聯合用藥比單獨用藥治療效果好。③莎爾福組與金雙歧組相比IL-4和TNF-α表達表現不顯著差異(P>0.05)，說明具有相當治療效果。

3 討論

慢性非特異性潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)簡稱潰結，潰瘍性結腸炎臨床上分四種類型：①初發型：可轉變為慢性復發型或慢性持續型；②慢性復發型：輕度充血、水腫，有典型的潰結病變；③慢性持續型：有輕重不等的腹瀉、間斷血便、腹痛及全身癥狀；④急性暴發型：起病急驟，全身及局部癥狀均嚴重，易發生中毒性結腸擴張，腸穿孔及腹膜炎。

慢性非特異性潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)臨床主要癥狀：①腹瀉或便秘；②黏液膿血便；③里急后重；④腹痛；⑤全身表現；⑥腸外表現。潰瘍性結腸炎具有急性暴發型病死率高；慢性持續型易反復發作癌變率高等特點。

慢性非特異性潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)結腸炎基本病理變化：①結腸中各種炎性細胞浸潤。②結腸中腺體萎縮、破壞、紊亂、基底膜斷裂和消失。③結腸中隱窩膿腫及潰瘍。④結腸黏膜下水腫及纖維化。⑤結腸黏膜杯狀細胞減少或消失以至上皮再生。

慢性非特異性潰瘍性結腸炎疾病病因多數學者認為與遺傳因素、免疫功能障礙、感染及精神因素等有關。近年來，潰結成為消化系統疾病研究熱點。劉丹等[13]金雙歧聯合柳氮磺胺吡啶治療潰瘍性結腸炎療效滿意，較單用柳氮磺胺吡啶好。宋清江等[14]金雙歧片配合辨證口服中藥治療潰瘍性結腸炎療效優于單純口服金雙歧和單純辨證口服中藥，而復發率卻低于單純口服金雙歧和單純辨證口服中藥。李慧等[14]治療潰瘍性結腸炎金雙歧片與美沙拉秦片聯合治療可獲得理想效果。

潰瘍性結腸炎發病機制世界衛生組織目前普遍認可原因是由免疫反應介導引起，在遺傳與環境及細菌協同作用下發生潰瘍性結腸炎，然而腸道內細菌是潰瘍性結腸炎發病引起的主要原因[11]。

IL-4主要由活化T細胞產生，IL-4對于B細胞、T細胞、肥大細胞、巨噬細胞和造細胞都有免疫調節作用。IL-4是T細胞自身分泌的生長因子，IL-4多數情況下對CTL和LAK細胞分化有正調節作用。IL-4多數報道認為潰瘍性結腸炎中減少非常明顯，臨床研究表明潰瘍性結腸炎患者IL-4基因表達同樣減少。IL-4刺激T、B淋巴細胞增殖抑制細胞因子，由于抑制巨噬細胞和T淋巴細胞產生和移動就抑制促炎作用，IL-4腸道中抑制腸黏膜維持腸道免疫平衡起關鍵作用[12]。

實驗研究發現潰瘍性結腸炎大鼠TNF-α含量明顯升高，而IL-4含量顯著減少，表明大鼠腸道抗、抑炎因子平衡被破壞。經過惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯合用藥3個治療潰瘍性結腸炎大鼠TNF-α含量顯著降低，而IL-4含量顯著升高，表明惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯合用藥治療潰瘍性結腸炎機制之一可能是抑制促炎因子TNF-α表達，提高抗炎因子IL-4表達。調整抗、抑炎因子平衡關系，使腸道抗、抑炎因子平衡恢復，腸道黏膜組織修復潰瘍得到良好治療。

實驗結果證實，應用惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯合用藥3個治療潰瘍性結腸炎大鼠TNF-α含量顯著降低，而IL-4含量顯著升高，可有效地改善大鼠一般狀況，大鼠腸黏膜充血與水腫及潰瘍明顯減輕，大鼠腹瀉癥狀明顯改善，腸黏膜病理損害明顯減輕，實驗組與對照組相比表現顯著差異性，說明惠迪、金雙歧對潰瘍性結腸炎治療均有效，聯合用藥效果更佳。

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1.黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目，編號：201610222038；2.佳木斯大學大學生科技創新項目，編號：xsym2016-02；3.佳木斯大學科學技術研究項目，編號：Sjz2012-15；4.黑龍江省教育廳項目，編號：12511570。

曲博新(1995～)男，黑龍江佳木斯人，在讀本科生。

顏玉(1963～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。E-mail:yanyu163.com。

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1008-0104(2017)02-0008-03

2016-11-02)