摻鎂-羥基磷灰石對牙周韌帶細胞的影響①

劉鑫喆,王健平,王佳琪,楊薇,黃歆博

(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

摻鎂-羥基磷灰石對牙周韌帶細胞的影響①

劉鑫喆,王健平,王佳琪,楊薇,黃歆博

(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究新型材料摻鎂-磷灰石對牙周韌帶細胞的增殖性毒性的影響，以及人牙周韌帶細胞對摻鎂-羥基磷灰石的黏附性的研究。方法:用體外方法培養人牙周韌帶細胞，將不同濃度的摻鎂羥基磷灰石(5%Mg—HA，10%Mg—HA)分別與牙周韌帶細胞共同培養。對照組為自固化磷酸鈣(CPC)，羥基磷灰石(HA)，玻璃離子(GIG)浸提液組。采用MTT法檢測細胞毒性以及增殖率。細胞核進行DAPI染色，觀察細胞對摻鎂羥基磷灰石的黏附情況。結果:MTT檢測結果表示為細胞增殖率自固化磷酸鈣>5%摻鎂羥基磷灰石>10%羥基磷灰石>羥基磷灰石>玻璃離子，各組比較具有顯著統計學意義。(P<0.05)每組材料20g/L、40g/L、80g/L濃度之間無統計學意義(P>0.05)。人牙周韌帶細胞對材料有一定的黏附性。結論：摻鎂羥基磷灰石對牙周韌帶細胞有良好的生物相容性，毒性小，有一定的促進牙周韌帶細胞黏附作用。為髓室底穿，根管側穿的修復工作提供了新的選擇。

摻鎂-羥基磷灰石；牙周韌帶細胞； 髓室底穿材料；生物相容性；細胞毒性

在臨床根管治療過程中，由于髓腔解剖的變異或操作者對髓腔的解剖知識了解不足，經常會遇到髓室底穿根管側穿的問題[1]。因為髓腔位置隱蔽、視野差、對醫生技術、修補材料要求較高，并且髓腔穿孔位置涉及到牙周組織和牙體組織，修補材料需要嚴密的封閉能力，以及良好的生物相容性，才能恢復牙周、牙體組織的健康。良好的修補材料，將很大程度的決定牙髓治療的成敗。羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]與牙體硬組織的無機成分極其相似，具有良好的生物相容性[2]。 為了更好的滿足臨床的需要,常常在人工合成的HA中添加一些元素來改善其臨床性能,含鎂羥基磷灰石(Mg-HA)就是其中的一種改新型的性材料[3]。據有關文獻記載，鎂在骨形成的初期具有重要作用，鎂可以提高成骨細胞的活性，鎂的缺乏可影響骨的代謝導致骨質疏松[4]。因此本實驗研究摻鎂-羥基磷灰石對牙周韌帶細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM培養基(HyClone生物化學制品有限公司);PBS(HyClone生物化學制品有限公司)膠原酶(TypeI,美國Gibco公司);胰蛋白酶(美國Gibco公司);胎牛血清(四季青生物工程公司);青鏈霉素溶液(雙抗)(HyClone生物化學制品有限公司)。

摻鎂羥基磷灰石(佳木斯大學材料學院)鎂的質量分數分別為5%，10%，本文5%Mg—HA為5Mg-HA,10%Mg—HA為10Mg-HA，不再贅述。共分5組，其中5Mg-HA、10Mg-HA為實驗組，對照組為玻璃離子，羥基磷灰石，自固化磷酸鈣。采用DMEM培養液配制各組材料浸提液，每組材料分別配置為80，40, 20g/L浸提液。

1.2 細胞的原代培養

經患者同意，取14～26歲的正畸拔除的雙尖牙(佳木斯大學附屬二院口腔頜面外科)牙齒拔出后，立即置于預冷4℃的含青霉素、鏈霉素的無血清DMEM培養液中。在超凈臺無菌條件下,用不含血清DMEM與PBS交替沖洗牙根部數遍,用手術刀輕柔地、向一個方向刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，將牙周膜組織分離成 1mm2左右的小組織塊。以1cm的間距分散擺放在細胞培養瓶底。緩慢輕柔將細胞培養瓶倒置，小心緩慢加入5mL含20%胎牛血清的DMEM培養液，置于飽和濕度，37℃的CO2孵箱內培養，4h后緩慢反轉培養瓶，使液體浸沒組塊，繼續培養。3～4d后，發現有細胞從組織邊緣爬出時，首次細胞換液。后每3～4天換液。待細胞有70%以上出現融合時，進行傳代培養。取 4～6代的細胞進行實驗。

1.3 方法

①MTT檢測細胞毒性：將牙周韌帶細胞接種于96孔培養板，每孔加入100μL的細胞懸液，細胞濃度為1×104個/mL，每組每濃度重復種植6個孔。在96孔板的四周加PBS液10μL，以保持96孔板的濕度。人牙周韌帶細胞在96孔細胞培養板中培養48h后,吸出原培養液,按上述分組加藥,每組分別設置6個復孔,37℃下繼續培養分別于1d、3d、5d、7d。其中3d組、5d組、7d組需每隔一天用對應浸提液換液1次，取出待測的96孔板，取浸提液與細胞作用的培養板，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃，體積分數為0.05的CO2飽和濕度環境下繼續培養4h，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入DMSO150μL，震蕩10min，酶聯免疫檢測儀570nm波長下測定各孔光吸收值，用單純培養液調零，取平均值。計算細胞相對增殖率。

②牙周韌帶細胞黏附性試驗：在細胞復合培養至第5、7天，取出細胞與材料，將各組材料制成直徑為10mm,高3mm的扁圓片狀試件。羥基磷灰石組為對照組。接種的細胞甲醛固定，每孔加入新鮮配制DAPI染液進行染色，并固定于載玻片，共聚焦激光熒光倒置顯微鏡下，用數碼攝像系統觀察并拍照觀察細胞核數量。

1.4 統計學方法

采用SPSS20.0數據分析軟件，進行方差分析和LSD的兩兩比較，以P<0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 不同濃度、不同時間下、牙周韌帶細胞增殖數目，不同濃度比較，不同濃度之間比較無統計學差異(P>0.05)。見圖1，不同時間點比較，1d和5d，3d和7d有統計學差異， 1d、3d比較(P<0.05)，1d和5d比較(P<0.01)，1d和7d比較(P<0.01)………組別之間倆倆比較均有意義。五組材料細胞增值率

為自固化磷酸鈣>5%摻鎂羥基磷灰石>10%摻鎂羥基磷灰石>純羥基磷灰石>玻璃離子。

圖1 牙周韌帶細胞增殖時間趨勢圖

2.2 細胞黏附性DAPI染色結果所示，隨著培養時間的增加，各組材料上的細胞數量有所變化。可以明顯看出，培養5，7d后，牙周韌帶細胞均正常黏附于各組材料，其中10Mg-HA培養7d后細胞數量染色較5d后有明顯的增多。5Mg-HA試件上的細胞在5d達到峰值。

圖2 人牙周韌帶細胞種植到各組材料上5d.7d.的DAPI染色免疫熒光(免疫熒光染色×100)

3 討論

眾所周知，髓室底穿根管側穿是根管治療常見的并發癥，其修復難度高，成功率低是困擾口腔醫師的常見問題。髓室底穿根管側穿對操作者的技術要求以及修補材料的性能的要求尤為嚴格,理想的修補材料須具有杰出的生物相容性,可激活成骨細胞成牙本質細胞，促進修復性牙本質的形成，封閉髓腔與根周組織的交通，形成良好的封閉。髓室底穿根管側穿修補材料因直接與牙周組織接觸,其生物相容性對牙周組織的恢復重建更為尤為重要。在國際慣例中，一種新型的口腔修補材料在臨床應用之前首先進行生物相容性的評價。MTT法是細胞毒性檢測的一種重要手段，該方法可以準確、迅速、靈敏地反映細胞增殖程度和細胞毒性程度， 此比色法是用于評價新型材料細胞毒性的最常用實驗方法之一，廣泛適用于各種新型材料生物相容性的評價。MTT染色后吸光度值比較，表明摻鎂羥基磷灰石與對照組比較差異均有顯著性意義(P<0.05)，說明摻鎂羥基磷灰石符合生物體應用的基本要求，據大文獻所述,傳統的氧化鋅、氫氧化鈣、玻璃離子、對治療髓室底穿有一定效果,但長期效果均不理想，可造成局部組織壞死，滲出。近期大量文獻報道MTA,具有良好的生物相容性、可關閉缺損部位及臨床可操作性，并且在濕潤環境下可以固化，但價格昂貴。據實驗表明MTA可以激活大量的成骨細胞，成骨細胞分泌類骨質成為骨細胞并被包埋于新骨之中，MTA中含有鈣、磷等元素，它與水反應后的產物含有氧化鈣和磷酸鈣的成分，氧化鈣與水反應形成最終形成氫氧化鈣。摻鎂羥基磷灰石鎂的摻入使羥基磷灰石更接近人體自然骨組織中天然羥基磷灰石的組成。鎂作為骨組織中羥基磷灰石的陽離子替代物在骨形成早期，因鎂、鈣離子之間的離子互換規律，鎂提高了成骨細胞的活性，而骨成熟后基本消失[5]。鎂的缺乏癥可導致骨質疏松，主要是因為通過抑制成骨細胞的數量、遷徙、分化和增加破骨細胞的數量[6～9]。摻鎂羥基磷灰石對髓室底穿部促進新骨形成，對牙周韌帶細胞生物相容性良好。由此可見摻鎂羥基磷灰石與MTA都可以誘導引導牙骨質類牙骨質，以及可利于牙周韌帶細胞的黏附，良好的生物相容性，這將是牙周組織重建不可取代的因素。因此,摻鎂羥基磷灰石作為乳、恒牙髓室底穿的屏障和修復材料是可行的,為最大限度地保存患牙,并恢復其生理功能提供了一種新型材料。

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佳木斯大學研究生科技創新項目，編號:LM2016_075。

劉鑫喆(1990～) 女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生。

王健平(1959～) 男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。E-mail:826452916@qq.com。

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1008-0104(2017)02-0047-02

2017-01-03)