益生菌聯合美沙拉嗪對大鼠潰瘍性結腸炎Claudin-1及TLR4的影響①

許海英，顏 玉，姜 威，陳 剛

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154003)

益生菌聯合美沙拉嗪對大鼠潰瘍性結腸炎Claudin-1及TLR4的影響①

許海英，顏 玉，姜 威，陳 剛

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154003)

目的:觀察益生菌對潰瘍性結腸炎大鼠腸組織中Claudin-1及TLR4的影響。方法：將SD大鼠32只隨機分為對照組、模型組、美沙拉嗪組、聯合治療組。對照組自由飲水7d，模型組及其他各組給予自由飲用5%的葡聚糖硫酸鈉溶液(DSS)7d以制備UC模型。后各組給予相應干預措施，7d后處死各組大鼠，HE染色觀察結腸組織改變，應用免疫組化的方法觀察各組大鼠腸組織中Claudin-1及TLR4的表達情況。結果:美沙拉嗪組TLR4的陽性細胞表達率低于模型組,而Claudin-1表達則高于模型組，差異有顯著性(P<0.05)。聯合治療組Claudin-1及TLR4的陽性細胞表達率與美沙拉嗪組相比,差異有統計學意義 (P<0.05),與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05)。結論：美沙拉嗪聯合益生菌有抑制TLR4的表達和促進Claudin-1表達的作用,較單獨應用美沙拉嗪效果更佳。

潰瘍性結腸炎；益生菌；Claudin-1；TLR4

潰瘍性結腸炎(UlcerativeColitis，UC)是一種病因尚不明確的主要限于結腸黏膜與黏膜下層的非特異性炎癥性腸病，呈連續性彌漫性分布。主要表現為反復發作的腹瀉、黏液膿血便及腹痛癥狀，病程呈慢性經過，發作與緩解交替，少數癥狀持續并逐漸加重。以往西方等發達國家和地區發病率相對較高，但隨著我國經濟發展及飲食結構的變化，近年來該病發病率也在日益增高[1]。TLR4 /NF-kB信號轉導通路是目前發現的重要的炎性通路之一,TLR4 /NF-kB信號通路主要經過髓樣分化因子 88 (myeloiddiffereniationfactor88,MyD88)依賴的信號通路及MyD88非依賴的信號通路激活NF-kB, 轉入細胞核中,激活炎癥因子引起炎癥反應[2]。claudins蛋白為腸黏膜上皮細胞緊密連接的重要組成部分，對維持腸黏膜屏障機械結構完整和正常功能發揮起重要作用。Claudin-1屬于緊密連接蛋白claudins家族，是構成緊密連接的主要骨架蛋白之一，Claudin-1蛋白的表達異常可引起黏膜屏障功能紊亂，導致緊密連接功能失調和組織滲透性的增加[3]。有專家發現UC患者腸道中有益菌群和有害菌群比例嚴重失衡，菌群紊亂在UC的發病過程扮演重要角色[4]，近年來，益生菌在UC的治療中越來越受到視，但其機制尚不明確，本研究通過應用美常安聯合美沙拉嗪治療DSS誘導UC大鼠模型，通過檢測Claudin-1及TLR4在結腸黏膜上的表達以探討其可能的作用機制，為臨床應用益生菌治療UC提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康清潔級6～8周齡，雄性SD大鼠32只，體質量200～230g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。分為對照組、模型組、美沙拉嗪組、聯合治療組。

1.2 材料和儀器

葡聚糖硫酸鈉DSS(Sigma公司),美沙拉嗪腸溶片(佳木斯鹿靈制藥公司),枯草桿菌二聯活菌腸溶膠囊(美常安)(北京韓美公司),Claudin-1、TLR4抗兔抗體(武漢博士德公司)。

1.3 方法1.3.1 動物模型制備

SD大鼠適應環境一周后，隨機抽取8只作為空白對照組，給予自由飲水，對其余大鼠參照Cooper等[5]的方法自由飲用5%的葡聚糖硫酸鈉溶液(DSS)7d，以制備潰瘍性結腸炎模型，造模后對照組及模型組給予等滲生理鹽水1mL/d灌胃，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪0.4g/kg·d溶于2mL生理鹽水中灌胃,聯合治療組給予美沙拉嗪0.4g/kg·d溶于2mL生理鹽水及美常安0.15g/kg·d溶于2mL生理鹽水中灌胃,觀察大鼠精神狀態，飲食、大便情況，體重變化。用藥7d后，禁食24h，麻醉處死大鼠，剃毛，75%酒精浸泡5min，剖腹，分離結腸，取結腸病變組織將其連續切成1cm長度的腸段，置于4%多聚甲醛進行組織固定，后組織塊常規石蠟包埋，連續切片(4μm)，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織形態學變化。

1.3.2Claudin-1及TLR4免疫組織化學染色

免疫組織化學法檢測結腸組織內Claudin-1及TLR4，具體操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。采用圖像分析軟件進行免疫組織化學圖片分析,并對OD值進行數據分析。

1.3.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行數據處理。各組資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析， `P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態

對照組大鼠精神狀態佳，常嬉戲打鬧，進食如常，毛發順滑、光澤，排便正常，體重增加。模型組大鼠精神萎靡、進食量減少，毛發暗淡無光澤、伴有稀便、血便，體重較前下降，美沙拉嗪組大鼠隨用藥時間的增加精神狀態較前恢復，毛發欠光澤，活動及進食增加，未見血便，體重稍有增加。聯合治療組大鼠癥狀好轉，未見血便。

2.2 肉眼觀察

對照組大鼠結腸黏膜光滑，未見充血、水腫。模型組大鼠結腸炎癥病變部位腸管增粗,腸道與周圍組織黏連明顯，多發潰瘍，充血水腫現象嚴重，甚至出現腹水。美沙拉嗪組病變部位腸黏膜存在充血、水腫、糜爛及潰瘍形成,但較模型組明顯好轉。聯合治療組腸道病變減輕，部分存在充血、水腫，糜爛、淺潰瘍。

2.3HE染色

對照組大鼠結腸黏膜完整，腺體排列整齊、杯狀細胞無減少。

圖1 模型組大鼠結腸病變主要累及黏膜層及黏膜下層，可見腺體大量破壞，排列極其紊亂，杯狀細胞減少，大量的炎性細胞浸潤，大量纖維素樣滲出。(HE×100)

圖2 美沙拉嗪組可見黏膜下層炎性細胞浸潤程度減輕，腺體排列不齊，少量纖維素樣滲出(HE×100)

圖3 聯合治療組可見少量炎性細胞浸潤，黏膜層及黏膜下層仍存有腺體破壞，黏膜下層可見肉芽組織增生(HE×100)

2.4 免疫組織化學染色

Claudin-1主要存在于腸上皮緊密連接的細胞膜上，為棕黃色染色顆粒。對照組大鼠腸道黏膜內可見棕黃色顆粒沉著，模型組大鼠腸道黏膜內很少見到棕黃色顆粒沉著，美沙拉嗪組可見到棕黃色顆粒沉著，但相對正常組較少，聯合治療組可見較多棕黃色顆粒沉著。

TLR4在各組腸道黏膜內均有表達。對照組大鼠腸道黏膜層內可見少許棕色顆粒沉著，與對照組比較，模型組大鼠腺體消失，可見多處棕色顆粒沉著，美沙拉嗪組黏膜里棕色顆粒沉著較多，但比模型組少。聯合治療組黏膜內棕色顆粒可見，但相對較少，黏膜炎癥較前減輕。

美沙拉嗪組TLR4的陽性細胞表達率低于模型組,而Claudin-1表達則高于模型組，差異有顯著性(P<0.05)。聯合治療組Claudin-1及TLR4的陽性細胞表達率與美沙拉嗪組相比,差異有統計學意義(P<0.05),與對照組相比,差異有意義(P<0.05)，見表1。

表1 結腸組織免疫組化Claudin-1及TLR4的OD值

注：與對照組比較*P<0.05,與模型組比較#P<0.05,與美沙拉嗪組比較&P<0.05,n為各組大鼠數量，其中模型組大鼠死亡1只。

3 討論

UC的發病機制尚不明確，可能與遺傳、環境及免疫失調等因素有關。近年來研究表明腸道黏膜免疫系統紊亂及黏膜屏障破壞均參與UC的病情發展。TLR4為Toll樣受體家族中的成員，其在正常結腸上皮細胞中呈低表達，從而降低對腸道中細菌脂多糖的識別，而在UC的結腸中呈高表達，對細菌脂多糖呈現異常識別[6]，后經下游轉導通路最終使NF-kB轉入核內，釋放促炎癥因子，介導腸道黏膜的天然免疫反應，進而擴大炎癥反應。譚芳等研究表明TLR4mAb抑制了大鼠UC模型TLR4 信號通路下游級聯反應對TLR4的正反饋作用，阻止了惡性循環，使TLR4及炎癥因子的表達下降，有助于控制腸道炎癥[7]。姜威等研究也表明TNBS誘導大鼠UC模型結腸組織的TLR2、TLR4、NF-kBmRNA和蛋白水平較對照組明顯升高[8]。腸道黏膜屏障可以抵御內、外源性微生物侵入體內，其中機械屏障起重要作用，claudins蛋白為腸道上皮結構重要組成部分，腸道上皮結構的完整可以維持腸上皮細胞極性和調節腸黏膜屏障的完整性,阻止有害物質侵入機體。Claudin-1為claudins蛋白家族中的一種，其在正常腸道黏膜中呈均勻分布，而在UC中表達則不同程度減少。研究發現在炎性反應性腸病活動期結腸黏膜固有層中，Claudin-1及其mRNA表達顯著降低，腸上皮通透性增加[3]。近年來人們對UC腸道內環境的研究越來越受到重視，有研究表明UC患者腸道菌群紊亂，有益菌減少而有害菌群比例上升，因此益生菌作為一種新的治療UC的方法越來越多的被學者們進行研究。雖然沒有確定具體的細菌與IBD的關系 ，但越來越多的證據表明，破壞道細菌和宿主防御機制中的黏膜(生態失調)的動態平衡可能觸發這種炎癥反應。慢性炎癥可導致細菌成分的滲透引起腸道屏障損傷[9]。本實驗通過應用美沙拉嗪聯合益生菌治療DSS誘導UC大鼠模型，可有效減少大鼠排便次數，腸道黏膜充血、水腫癥狀較模型組減輕，腸道組織TLR4表達較對照組表達升高，Claudin-1表達較對照組減少但較單獨應用美沙拉嗪有所增加，差異有統計學意義，考慮腸道黏膜屏障功能有所恢復，而聯合用藥治療效果更明顯。美常安可能通過調節免疫應答反應及修復腸道黏膜屏障來治療UC，但具體作用機制還需進一步研究及探討。

[1]冉志華,劉文忠.炎癥性腸病[M].北京: 人民衛生出版社，2009

[2]謝晶日,張冰.Toll樣受體4與潰瘍性結腸炎相關性研究[J]. 中華中醫藥學刊,2012,30(7):1452-1454

[3]馬軍宏,于向陽.緊密連接蛋白與腸黏膜屏障損傷研究進[J].中國中西醫結合外科雜志,2015,21(1):104

[4]AbdinAA，SaeidEM．AnexperimentalstudyonulcerativecolitisasapotentialtargetforprobiotictherapybyLactobacillusacidophiluswithorwithout"olsalazine"[J].JCrohn's&colitis,2008,2:296

[5]CooperHS，Murthysn,Shahrs，etal.ClinicopathologicstudyofdextransulfateSodiumexperimentalmurinecolitis[J].LaboratoryInvestigation;aJournalofTechnicalMethodsandPathology,1993,69(2):238- 249

[6]SinghJC,CruickshankSM,NewtonDJ,etal.Toll-likereceptor-mediatedresponsesofprimaryintestinalepithelialcellsduringthedevelopmentofcolitis[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2005,288:514-524

[7]譚芳,高鴻亮.TLR4mAb對急性潰瘍性結腸炎模型大鼠TLR4、TNF-α、IL-1β表達的影響[J]. 現代生物醫學進展,2015,15(14):2629-2632

[8]姜威,顏玉. 潰瘍性結腸炎Toll樣受體表達和NF-kB變化及益生菌的作用研究[J]. 黑龍江醫藥科學,2013,36(5):34-35

[9]KatalinMüllner,PálMiheller.ProbioticsintheManagementofCrohn'sdiseaseandUlcerativeColitis[J].CurrentPharmaceuticalDesign,2014,20：4556-4560

佳木斯大學研究生科技創新，編號：LM2015_019。

許海英(1990～)女，黑龍江大慶人，在讀碩士研究生。

顏玉(1963～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail：jmsyanyu1963@163.com。

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1008-0104(2017)02-0049-03

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