PCDH8基因啟動子在前列腺癌組織及細胞中的甲基化測定及其臨床意義①

齊文千,牛文斌

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科,黑龍江 佳木斯 154003)

PCDH8基因啟動子在前列腺癌組織及細胞中的甲基化測定及其臨床意義①

齊文千,牛文斌

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：檢測PCDH8基因啟動子在前列腺癌細胞PC3、DU145、LNCap及組織中的甲基化狀態(tài)，并探討其臨床意義。方法：應用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(MSP)檢測42例前列腺癌組織，35例前列腺增生組織，前列腺癌細胞PC3、DU145、LNCap，人正常前列腺細胞RWPE-1、WPMY-1中PCDH8基因啟動子甲基化情況，并分析臨床資料。結果：甲基化存在于19例(19/42)前列腺癌患者組織以及全部3株前列腺癌細胞(3/3)中，而不存在于35例前列腺增生組織及2株正常前列腺細胞中(0/2)；并且甲基化與較高的Gleason評分，較高的術前PSA以及較高的病理分期相關。結論：前列腺癌中常出現(xiàn)PCDH8基因啟動子甲基化，且與預后不良及更強的轉移能力相關，有可能成為潛在的生物標記物。測定腫瘤組織中的PCDH8基因啟動子甲基化狀態(tài)可以有助于確定需要積極臨床干預的患者來改善預后。

前列腺癌；PCDH8；DNA甲基化

前列腺癌是一種常見的實體惡性腫瘤，在美國等發(fā)達國家，長期占據(jù)著男性惡性腫瘤的第一位。目前，我們尚不能完全解釋前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機制，臨床上大部分患者出現(xiàn)癥狀時已經(jīng)進展到了中晚期。現(xiàn)在，在臨床上廣泛使用前列腺特異抗原(PSA)篩查前列腺癌，但是PSA也有局限性[1]，其檢查結果可靠性不高，尚不能對前列腺癌的危險程度進行適當?shù)脑u估。因此，我們就需要積極尋找新的具有特異性的標志物來幫助早期篩查前列腺癌，并評估預后。近些年，國內外學者普遍認為表觀遺傳學在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著一定的甚至是至關重要的作用。表觀遺傳學是在不改變基因序列的前提下，通過DNA甲基化的改變，染色體重塑，組蛋白修飾等來調控基因的表達，貫穿腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程[2]。其中研究較深入的是DNA甲基化，它的改變可以增加或者沉默相關基因的表達。近來PCDH8作為一種新型的抑癌基因得到關注，它可以在某些腫瘤發(fā)生啟動子的高甲基化使基因表達減少甚至消失，來參與腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展。PCDH8基因是原鈣黏素基因家族中的一員，在介導細胞黏附，遷移，侵襲等方面都起著作用，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。其啟動子異常高甲基化已經(jīng)被證實存在于例如腎癌，膀胱癌等多種人類癌癥中，被認為與較差的預后相關[3～5]，并可能獨立預測前列腺癌患者的無生化復發(fā)生存時間[3]。然而，目前較少有關于前列腺癌組織及細胞中PCDH8基因啟動子甲基化情況的報道，本研究以前列腺癌組織及細胞為研究對象，檢測其PCDH8基因啟動子甲基化狀態(tài)，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 標本收集

收集2015-01～2016-06在佳木斯大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科行前列腺癌根治術或經(jīng)尿道前列腺電切術的前列腺癌患者和前列腺增生患者的術后標本，均經(jīng)術后病理診斷證實。樣品收集之后應用液氮快速冷凍，然后儲存在-80℃冰箱中。

1.2 細胞培養(yǎng)

按照常規(guī)的細胞培養(yǎng)程序，人前列腺癌細胞PC3使用含15%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液，置于5%CO2，37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，人前列腺癌細胞DU145、LNCap培養(yǎng)基含10%胎牛血清，其他條件不變。人正常前列腺細胞RWPE-1、WPMY-1使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.3DNA提取及亞硫酸鹽修飾

從冰箱中取出收集的樣本，使用組織DNA提取試劑盒，按照說明書上的步驟提取組織DNA。取對數(shù)期細胞，使用細胞DNA提取試劑盒，按照操作步驟進行操作提取細胞DNA。用紫外分光光度儀檢查，DNA濃度合格的標本-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肊ZDNAMethylation-GoldKit(zymoresearch美國，貨號：D5005) 進行亞硫酸氫鹽修飾，經(jīng)甲基化修飾后置于-20℃保存。

1.4 甲基化特異性PCR

以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板，使用已經(jīng)報道的引物序列[3,4]，由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成引物，具體引物序列見表1。之后分別進行PCR擴增。反應體系如下：12.5μLZymoTaqPreMix，2ul模板，上下游引物各1μL，ddH20補足至25μL。反應條件：95℃ 5min，1個周期預變性；94℃ 30s、退火 60℃ 30s、延伸 72℃ 30s，40個周期變性；72℃ 5min，1個周期。取10μLMSP擴增產物進行電泳，紫外燈下觀察結果。甲基化正向存在條帶記為陽性，條帶只在未甲基化DNA出現(xiàn)的樣品記為甲基化陰性[3,4]。

表1 MSP 中PCDH8 基因甲基化引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0處理，用卡方檢驗或Fisher確切概率法進行分析。P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

①PCDH8基因啟動子甲基化存在于全部3株人前列腺癌細胞中，且PC3和DU145甲基化程度略高于LNCap細胞，而在2株人正常前列腺細胞中均未發(fā)現(xiàn)存在甲基化(圖1)。②檢出存在PCDH8基因啟動子甲基化的前列腺癌樣本19例(19/42)，前列腺增生組織中均未發(fā)現(xiàn)甲基化的存在，兩者之間差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2)。③分析19例存在PCDH8基因啟動子甲基化與23例未發(fā)現(xiàn)甲基化的前列腺癌病例的臨床資料。發(fā)現(xiàn)Gleason評分、術前前列腺特異性抗原(PSA) 和術后病理分期差異存在統(tǒng)計學意義，而年齡差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

圖1 細胞系中的MSP結果

圖2 前列腺癌組織中PCDH8基因啟動子甲基化具有代表性的MSP結果。M：甲基化;U：未甲基化。Pca1和Pca2為甲基化，Pca3為非甲基化

表2 42例前列腺癌患者的臨床資料

3 討論

進入新世紀以來，我國前列腺癌的發(fā)病率快速增長。現(xiàn)有的篩查方法PSA具有一定的局限性，尋找早期篩查前列腺癌，并評估風險的標志物就顯得尤為重要。目前，科學家普遍認為除基因突變和染色質丟失外，第三種導致抑癌基因失活的機制是甲基化，有時甚至是唯一的機制[6]。DNA甲基化水平的變化，在前列腺癌中被認為出現(xiàn)相對較早，甚至是癌前病變階段，可使用PCR方法檢測，比較敏感，可能成為理想得生物標志物。所以一些基因，在正常組織中無甲基化，若出現(xiàn)異常的甲基化表現(xiàn)，即有腫瘤發(fā)生的可能性。

PCDH8基因位于人類染色體的13q14.3，它含有6細胞外鈣黏蛋白結構域，一個跨膜結構域和胞質區(qū)[3]。國內外尚未有發(fā)現(xiàn)PCDH8基因啟動子甲基化存在于完全正常的組織中的報道，但是在多種腫瘤組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其存在啟動子異常高甲基化，進而使基因表達沉默。本研究顯示，PCDH8基因啟動子甲基化較多的出現(xiàn)在前列腺癌組織及細胞中，而在前列腺增生組織及正常前列腺細胞中均未檢測到甲基化。由此可以推斷，PCDH8基因啟動子甲基化不存在于正常前列腺或增生組織中，具有前列腺癌腫瘤特異性。因此我們有理由認為：PCDH8 基因啟動子甲基化僅發(fā)生于前列腺癌組織中，再次證明了使用PCDH8基因啟動子甲基化早期篩查前列腺癌的可能性。此外，我們比較了42例前列腺癌患者的臨床資料與PCDH8基因啟動子甲基化之間的關系，發(fā)現(xiàn)Gleason評分≥7分，術前PSA≥10ng/mL以及較高的術后病理分期與患者PCDH8甲基化顯著相關，說明存在PCDH8基因啟動子甲基化的患者，其危險等級相對更高，可能和患者的預后不良有關。這有助于我們篩選出患者，并給予更加積極的術后治療以及隨訪。但由于實驗時間較短，對所研究患者的長期隨訪不足，我們尚無法明確PCDH8基因啟動子甲基化與前列腺癌患者預后的關系。

人前列腺癌細胞LNCap、DU145和PC3是常見的三種前列腺癌細胞系，其中實驗中常認為LNCap具有前列腺癌早期特征，是早期雄激素依賴性前列腺癌，轉移潛能相對較弱；而PC3和DU145具有雄激素非依賴性，其中PC3具有中等強度的轉移潛能，而DU145則具有強大的轉移潛能[7]。本實驗首次驗證了這三種前列腺癌細胞系中PCDH8基因啟動子甲基化情況，實驗結果顯示，甲基化存在于全部三種細胞中，并且PC3和DU145的甲基化水平高于LNCap。因此，我們有理由推測較高的PCDH8基因啟動子甲基化程度意味著較強的轉移能力，這與認為其介導細胞黏附侵襲等作用的觀點相一致。而轉移是臨床上實體腫瘤患者主要的死亡原因，所以更強的轉移能力意味著需要更加積極的術后治療以及隨訪，這也與我們前面提到的結論相一致。

本實驗患者數(shù)少，并且缺乏長期的術后隨訪，使我們很難得出患者預后與PCDH8基因啟動子甲基化水平的相關性，這些都將繼續(xù)完善。此外，已有在血液樣本中檢測PCDH10基因啟動子甲基化情況的相關報道[8]。我們也將嘗試在血、尿等患者體液中檢測PCDH8基因的啟動子甲基化情況，為前列腺癌的早期篩查提供新的依據(jù)。

[1]馬雷，辛華.血清總PSA、游離PSA檢測在前列腺癌診斷中的臨床應用[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2007,30(2)：11-12

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[7]林艷端，申鍔，胡兵.三種常見的前列腺癌細胞系LNCap、PC3和DU145的生物學特性[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7(11)：4980-4982

[8]吳旭鵬，郭玉剛，牛文斌.前列腺癌患者血清PCDH10 甲基化檢測及臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2016，39(4)：120-123

2016年佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目，編號：YM2016_038。

齊文千(1990～)男，河北黃驊人，在讀碩士研究生。

牛文斌(1972～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E-mail:niuwenbin@sina.com。

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1008-0104(2017)02-0052-02

2016-11-18)