植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優化

司天昭，柳陳堅，秦曉萌，李曉然，羅義勇，楊 恩

植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優化

司天昭，柳陳堅，秦曉萌，李曉然，羅義勇，楊 恩*

（昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

對從云南傳統發酵豆豉分離得到的植物乳桿菌YM-2（Lactobacillus plantarum YM-2）菌株胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）生物合成條件進行優化。首先對培養基成分中的碳源、氮源種類進行篩選；然后利用單因素試驗分析碳源含量、氮源含量、培養時間以及培養溫度對EPS產量的影響；最后采用Box-Behnken法進行四因素三水平響應面分析以確定其最優工藝條件。結果表明，植物乳桿菌YM-2菌株生物合成EPS最佳條件為碳源（葡萄糖）含量30 g/L、氮源（酵母粉）含量30 g/L、培養時間30.05 h、培養溫度36.36 ℃，在此工藝條件下，植物乳桿菌YM-2 EPS產量為257.362 mg/L。

植物乳桿菌；胞外多糖；條件優化；響應面法

乳酸菌利用的歷史悠久，是一種公認的安全型微生物。當前乳酸菌在食品行業中應用廣泛，與人體健康關系密切[1]。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是一種次生代謝產物，與細胞松散連接，并且可以直接分泌至細胞外環境中[2]。與植物多糖和動物多糖相比，由于微生物EPS的生產受地理環境及氣候條件等自然因素的影響較小，并且其產量及質量穩定，性價比較高。另外EPS除具有良好的增黏性、耐鹽性、抗溫性、抗剪切性等理化特性外，還具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化[3]以及改善胃腸道機能[4]等多種生理機能，因此在食品和制藥領域具有廣闊的應用前景。但是，當前乳酸菌EPS的應用還很有限，主要原因是多糖產量過低，生產和提取成本很高。通過合成條件的研究可以發現影響EPS產量的關鍵因素，加之基因工程技術能夠定向改造乳酸菌的遺傳物質，這些方法都可以有效提高多糖產量并降低成本。

自然界中很多乳酸菌可以生物合成EPS，植物乳桿菌就是其中一類。乳酸菌EPS產量受諸多因素影響，乳酸菌菌株本身起決定性作用。不同乳酸菌在乳培養基中產EPS的范圍不同，如噬熱鏈球菌EPS產量為50～360 mg/L，干酪乳桿菌EPS產量為50～60 mg/L[5]。不同植物乳桿菌在MRS培養基中，EPS產量不同。EPS產量的范圍為29.86～324.80 mg/L[6-9]。優化條件后G1德氏乳桿菌保加利亞亞種EPS產率提高17.8%[10]，干酪乳桿菌LC2W在優化培養成分后，EPS產量提高28.75%[11]，Lactobacillus reuteri-YR在最優發酵條件下，EPS實際產量可高達7 214.4 mg/L[12]，這就使EPS的工業應用成為可能。除菌種因素外，培養基組成、培養條件等都會影響乳酸菌EPS產量[5]，因此可以通過優化EPS生物合成的條件提高多糖產量。

本研究以EPS產量作為指標，通過單因素試驗對EPS的培養基成分及培養條件進行研究，并通過Box-Behnken響應面法分析各因素之間交互作用對EPS產量的影響，進一步確定從云南傳統發酵豆豉分離得到的植物乳桿菌YM-2菌株（Lactobacillus plantarum YM-2）[13]生物合成EPS的最優條件，從而提高其EPS產量，為進一步研究EPS生物學活性提供良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：從云南傳統發酵豆豉分離得到的Lactobacillus plantarum subsp. plantarum YM-2菌株[14]。

MRS培養基（微生物干粉培養基質控圖解手冊）：蛋白胨10.0 g、牛肉粉8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、K2HPO42.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、吐溫1 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，115 ℃滅菌20 min。

硫酸（分析純） 重慶川東化工（集團）有限公司；三氯乙酸（分析純） 天津市光復精細化工研究所；碳酸氫鈉、苯酚（均為分析純）天津市風船化學試劑科技有限公司；乙二胺四乙酸（分析純） 生工生物工程（上海）有限公司；MD34透析袋（1 000 D） 上海有漁實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

3-18K離心機 美國Sigma公司；FD5-12真空冷凍干燥機 美國SIM公司；Ultrospec 2100 pro紫外-可見分光光度計 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌EPS的提取純化[15]

對活化的菌種用血球計數板進行細胞計數，通過稀釋的方法保持接種前細胞數量一致，之后根據體積比接種。植物乳桿菌按體積分數2%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h；培養液4 ℃、10 000×g離心30 min，取上清液；加三氯乙酸至質量分數為4%，10 000×g離心15 min，取上清液；3 倍體積的預冷無水乙醇－20 ℃沉淀過夜；4 ℃、12 000×g離心30 min收集沉淀；待乙醇完全蒸發，加入2 mL的雙蒸水溶解沉淀，轉移到經過前處理的透析袋中透析2 d，其間8 h換水一次；收集透析液，真空冷凍干燥得到植物乳桿菌的EPS。

1.3.2 EPS產量的測定

利用苯酚-硫酸法[16]測定EPS含量。以葡萄糖為標準品作標準曲線，得到回歸方程為y=13.307x+0.023，R2=0.996 9，曲線擬合良好。通過回歸方程計算植物乳桿菌YM-2的EPS產量。

1.3.3 產糖培養基成分的優化

1.3.3.1 最佳碳源的篩選

選取葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及果糖和蔗糖混合碳源替代MRS培養基中的碳源，其他成分不變。每種碳源類型的含量確定為20 g/L，37 ℃培養24 h。

1.3.3.2 最佳氮源的篩選

將MRS培養基中的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉選定為研究因素，每種氮源的含量確定為20 g/L，除氮源外，培養基中其他成分不變。培養條件為37 ℃、24 h。

1.3.4 培養條件的優化

已報道的影響乳酸菌EPS產量的條件包括：碳源、氮源、培養時間、培養溫度、培養基初始pH值等[17]。本研究首先通過單因素試驗篩選發酵條件，再通過響應面試驗[18]，得出植物乳桿菌YM-2菌株生物合成EPS的最優培養條件。

1.3.4.1 單因素試驗優化

根據優化結果，本研究選定葡萄糖、酵母粉分別作為培養的碳源和氮源。在接種量2%、其余成分與MRS培養基成分比例一致、37 ℃培養24 h條件下，測定不同葡萄糖含量（10、15、20、25、30 g/L）對EPS產量的影響。在接種量2%、葡萄糖含量20 g/L、37 ℃培養24 h條件下，測定不同酵母粉含量（10、15、20、25、30 g/L）對EPS產量的影響。在接種量2%、碳源為葡萄糖20 g/L、氮源為酵母粉20 g/L、37 ℃培養條件下，測定不同培養時間（12、16、24、30、36 h）對EPS產量的影響。在接種量2%、碳源為葡萄糖20 g/L、氮源為酵母粉20 g/L、培養24 h條件下，測定不同培養溫度（32、35、37、40、42 ℃）對EPS產量的影響。

1.3.4.2 響應面試驗設計

響應面優化可以通過擬合回歸方程以構建連續變量曲面預測模型，從而能夠對不同因素水平及其交互作用進行優化和評價，所需試驗次數較少，因此被成功地應用于各種優化過程[19-20]。根據單因素試驗結果，選取碳源含量、氮源含量、培養時間、培養溫度4 個因素，以EPS產量為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理[21]，設計四因素三水平響應面試驗。每組試驗重復3次。

1.4 數據處理

單因素試驗設計中每項因素試驗重復3 次，數據結果使用SPSS 22.0軟件對其進行方差分析（One-Way ANOVA）。具體選用事后多重比較中假定方差齊性為LSD和Duncan，選項statistics為描述性，缺失值選擇按分析順序排除個案。采用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件進行試驗設計、模型建立和數據分析。

2 結果與分析

2.1 培養基營養成分對EPS產量的影響

2.1.1 碳源種類對EPS產量的影響

圖 1 碳源種類對菌株YM-2 EPS產量的影響Fig. 1 Effects of carbon sources on the EPS yield of strain YM-2

由圖1可知，植物乳桿菌YM-2能利用多種碳源生物合成EPS。當葡萄糖、蔗糖和果糖混合為碳源與蔗糖、果糖、乳糖為碳源兩者存在顯著差異（P＜0.05）。當糖源為葡萄糖時，YM-2的EPS產量略高于糖源為蔗糖和果糖混合物，因此選擇葡萄糖作為乳酸菌發酵的糖源。而從印度發酵飲料（Kyiad pyrsi）分離得到的菌株Leuconstoc lactis[22]當碳源為蔗糖時，EPS產量最高。Lactobacillus ke ranofaciens[23]、Lactobacillus strain A[24]當碳源為乳糖時，EPS產量最高。說明優勢碳源的利用具有菌株差異性。

2.1.2 氮源種類對EPS產量的影響

氮源是乳酸菌合成EPS所必需的養分，不同的氮源和適量的添加量對菌體分泌EPS均有一定的影響[25]。由圖2可知，該菌株能利用多種氮源進行發酵產糖。3 種不同的氮源對植物乳桿菌菌株YM-2 EPS產量的影響具有極顯著性差異（P＜0.001），當氮源為酵母粉時，該菌株的EPS產量最大，因此選擇酵母粉作為乳酸菌發酵的氮源。氮源主要通過影響微生物生長速率影響EPS等代謝的合成[26]。與植物乳桿菌YM-2不同的是，從在奶酪乳清生長分離得到的kefiran[27]、從發酵穇子分離得到的Lactobacillus strain A[11]、Lactobacillus casei LC2W[28]在利用的氮源分別為酵母提取物、酪蛋白水解物、蛋白胨時，EPS產量達到最大值。說明優勢 氮源的應用具有菌株差異性。

圖 2 氮源種類對菌株YM-2 EPS產量的影響Fig. 2 Effects of nitrogen sources on the EPS yield of strain YM-2

2.2 培養條件的優化

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 葡萄糖含量對EPS產量的影響

圖 3 葡萄糖含量對菌株YM-2 EPS產量的影響Fig. 3 Effects of glucose concentration in the medium on the EPS yield of strain YM-2

由圖3可知，葡萄糖含量對植物乳桿菌EPS產量影響不大，當葡萄糖含量為10 g/L時，植物乳桿菌YM-2的EPS產量為（224.24±0.651）mg/L；當葡萄糖含量達到20 g/L時，EPS產量達到最大（228.684±0.483）mg/L；當葡萄糖含量達到25 g/L時，EPS產量有所下降；當葡萄糖含量為30 g/L時，EPS產量為（222.183±0.710）mg/L。葡萄糖含量較低時，EPS產量隨著葡萄糖含量的提高而增多；當達到一定階段時，EPS產量又隨著葡萄糖含量的提高而下降。葡萄糖的含量較高時可以抑制乳酸菌EPS的合成。與此不同的是Lactobacillus cinfusus[28]在糖源含量高的條件下，EPS產量高。而Bacillus licheniformis[29]在糖源含量很低條件下，EPS產量反而會很高。這種現象是由于所研究的植物乳桿菌YM-2菌株中可能存在不同單糖轉運與轉化系統，乳酸菌可以通過這些轉運系統控制進入細胞的碳源的量，轉化系統又可以實現不同碳源的轉化，使得菌體獲得其所需要的糖。碳源表現的高濃度抑制EPS合成的現象表明菌體細胞中具有反饋抑制體系，這對EPS的生產應用是巨大的不利因素，因此研究碳源代謝體系，解除反饋抑制是另一個重要方面。

2.2.1.2 酵母粉含量對EPS產量的影響

圖 4 酵母粉含量對菌株YM-2 EPS產量的影響Fig. 4 Effects of yeast powder concentration in the medium on the EPS yield of strain YM-2

由圖4可知，植物乳桿菌YM-2的EPS產量與酵母粉的含量呈正相關關系，當酵母粉含量為10 g/L時，EPS產量為（170.163±1.689）mg/L；隨著酵母粉含量的增加，EPS產量不斷增加，當酵母粉含量為30 g/L時，EPS產量達到（256.561±1.138）mg/L。當酵母粉含量較高時，EPS產量雖然還在增加，但增速有所減緩。在酵母粉含量在10～30 g/L范圍內，植物乳桿菌YM-2的EPS產量沒有下降趨勢，因此可以確定氮源的種類和含量對EPS的合成起到了極為重要的作用。與之不同的是Lactobacillus LB 121[30]在高糖源（100 g/L）存在、缺乏氮源（MRS培養基配方中氮源）培養基中，EPS含量會升高。氮源對EPS合成的影響巨大，這可能是由于在植物乳桿菌YM-2中，氮源通過影響 EPS合成相關酶類的合成進而影響EPS的合成[31]。

2.2.1.3 培養時間對EPS產量的影響

圖 5 培養時間對菌株YM-2 EPS產量的影響Fig. 5 Effect of culture time on the EPS yield of strain YM-2

由圖5可知，培養時間對植物乳桿菌EPS的生物合成具有重要影響。當培養時間較短時，乳酸菌EPS產量隨著時間的延長而提高；當某個時間點達到最大合成量后，EPS產量又隨著時間的延長而下降。這說明隨著時間的延長，當培養液的環境變得惡劣，營養物質無法滿足乳酸菌的生長需要時，乳酸菌開始分解利用EPS以滿足自身的生長。

2.2.1.4 培養溫度對EPS產量的影響

圖 6 培養溫度對菌株YM-2 EPS產量的影響Fig. 6 Effect of culture temperature on the EPS yield of strain YM-2

由圖6可知，培養溫度對植物乳桿菌YM-2的EPS的生物合成具有重要影響。溫度較低時，隨著溫度的提升EPS產量增加。當產量達到最大值后，溫度再繼續升高EPS產量出現下降。培養溫度的影響表現為低溫和高溫都會抑制EPS的合成，只有在最適培養溫度時EPS產量才能達到最高。

2.2.2 響應面試驗結果

2.2.2.1 響應面試驗設計與結果及方差分析

根據四因素三水平的響應面試驗設計，共設立29 個試驗點，試驗方案及結果見表1。

表 1 響應面試驗設計與結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

表 1 響應面試驗設計與結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

試驗號 A葡萄糖含量/（g/L）EPS產量/（mg/L）120202437212.152 220203632174.779 320201242172.474 42010244272.977 530202432177.985 630203637192.914 72010363735.37 830202442164.124 9 20202437212.152 102010243297.927 1130302437239.072 1210202432174.445 1330201237167.664 1420302432263.955 1520202437212.152 1620201232164.258 1710203637167.364 1820202437212.152 1910201237179.221 201010243793.318 213010243783.031 2220202437212.152 2320203642171.472 2420301237243.013 252010123784.634 2610202442176.215 2710302437298.222 2820302442252.766 2920303637261.583 B酵母粉含量/（g/L）C培養時間/h D培養溫度/℃

利用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件對表1試驗數據進行回歸擬合分析，得到植物乳桿菌YM-2菌株EPS產量（Y）對葡萄糖含量（A）、酵母粉含量（B）、培養時間（C）、培養溫度（D）4 個因素的回歸方程為：

Y=212.15－5.33A+90.95B－0.65C－3.61D－12.22AB+9.28AC－3.91AD+16.96BC+3.44BD－2.88CD－13.08A2－24.04B2－25.43C2－19.35D2

表 2 回歸方程方差分析結果Table 2 Analysis of variance (AOVNA) of regression model

如表2所示，響應面方差分析所得的結果顯著，說明試驗結果可靠，預測結果與試驗結果符合度很好，結果可信[21]。其中R2（0.980 8）與（0.961 6）值相近，而變異系數為6.83%，小于10%，說明模型可靠，在試驗因素和水平條件下能夠準確預測植物乳桿菌EPS的產量。

對回歸方程各項進行方差分析，結合A、B、C、D各因素F值的大小，可以得出4 個因素對EPS產量影響的次序為：酵母粉含量＞葡萄糖含量＞培養溫度＞培養時間。其中B、B2、C2、D2對EPS產量的影響極顯著，BC、A2對其影響顯著，其余項對其影響不顯著。

2.2.2.2 響應面交互作用結果

固定其中2 個因素，利用Design-Expert軟件對試驗數據進行二元多次回歸擬合，所得方程響應面如圖7所示。基于考察的試驗條件范圍內，結果顯示：在葡萄糖含量與酵母粉含量的交互作用中，葡萄糖含量對EPS產量影響不大，不同葡萄糖含量條件下EPS產量相對穩定。而酵母粉含量對EPS的合成影響較大，酵母粉含量與EPS產量呈現正相關性（P＜0.001），當酵母粉含量較高時EPS產量的增加有所減緩（圖7a）。葡萄糖含量與培養時間互相作用明顯，葡萄糖含量和培養時間水平增加到一定量時，EPS產量出現峰值隨后下降（圖7b）。葡萄糖含量與培養溫度的交互作用中，EPS產量也呈現出相似的趨勢（圖7c）。

與酵母粉含量單因素試驗相似，在酵母粉含量與培養時間的交互作用中，EPS產量與酵母粉含量具有正相關關系。而此時培養時間的作用與單因素試驗不同，EPS產量只是在較短培養時間內和較長時間培養時略有下降，而在整個培養時間段內EPS產量變化并不大。在酵母粉含量與培養溫度的交互作用中得到的結論也是相似的。EPS產量與酵母粉含量具有正相關關系。在較低和較高培養溫度時EPS產量有所下降，而不同培養溫度對EPS產量影響不大，沒有單因素試驗中的影響顯著（圖7d、7e）。

在培養時間和培養溫度的交互作用中，培養時間與培養溫度的作用都是顯著的。在培養時間和培養溫度都較低時，EPS產量隨著培養時間或溫度水平的提高而增加。當達到最大量后又隨著時間或溫度水平的提高而下降，時間和溫度過低或過高時都會抑制EPS的合成（圖7f）。

圖 7 各因素交互作用對菌株YM-2 EPS產量的影響Fig. 7 Response surface plots showing the effects of various factors on the EPS yield of strain YM-2

由響應面優化得到EPS合成最優條件分別為葡萄糖含量30 g/L、酵母粉含量30 g/L、培養時間30.05 h、培養溫度36.36 ℃，理論EPS產量為255.254 mg/L，這與驗證實驗獲得的實際產量257.362 mg/L相近，因此認為通過響應面試驗設計獲得的模型是可信的。植物乳桿菌70810在發酵條件優化（蔗糖含量34 g/L、接種量5%、發酵溫度31 ℃）后，EPS產量從64.17 mg/L[32]提高到425.16 mg/L[33]。植物乳桿菌C88經過發酵條件優化（初始pH 7.0、發酵溫度37 ℃和添加2%果糖作為碳源），EPS產量從29.86 mg/L提高到40.96 mg/L[6]。植物乳桿菌YM11在優化的發酵條件下，EPS產量為129.915 mg/L[10]。本實驗植物乳桿菌YM-2在優化培養條件后EPS產量由（25.450±1.389）mg/L提高到（257.362±0.781）mg/L，產量提高效率達到90.11%，與植物乳桿菌70810產量提高率（84.91%）和植物乳桿菌C88產量提高率（27.10%）均要高。這可能是因為在優化葡萄糖含量與培養溫度的同時，也優化了酵母粉含量和培養時間。實驗結果達到了預期結果，為今后更深入研究植物乳桿菌YM-2所產EPS的結構、生理功能以及機理的闡明提供研究基礎，也為其進一步商業化發展提供了參考。

3 結 論

本實驗通過單因素試驗分析了植物乳桿菌YM-2合成EPS的最佳條件，并采用Box-Behnken設計及響應面分析，建立植物乳桿菌YM-2發酵條件的二次多項模型。經檢驗證明該模型具有可靠性，能較好地預測EPS產量。利用模型的響應面分析，得到最佳發酵條件為碳源（葡萄糖）含量30 g/L、氮源（酵母粉）含量30 g/L、培養時間30.05 h、培養溫度36.36 ℃，此條件獲得的實際EPS產量為257.362 mg/L。這為今后更深入研究植物乳桿菌YM-2結構、生理功能以及機理的闡明提供理論依據，也為其進一步商業化發展提供了參考。

[1] 張筠, 劉寧, 孟祥晨. 乳酸菌胞外多糖生物學活性[J]. 國外醫學: 衛生學分冊, 2004, 31(4): 227-230.

[2] RUAS-MADIEDO P, HUGENHOLTZ J, ZOON P. An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2002, 12: 163-171. DOI:10.1016/S0958-6946(01)00160-1.

[3] JI W, XIAO Z, ZHENG T, et al. Characterization of an exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum YW11 isolated from Tibet Kefir[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 125: 16-25. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.03.003.

[4] NWODO U U, GREEN E, OKOH A I. Bacterial exopolysaccharides: functionality and prospects[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(11): 14002-14015. DOI:10.3390/ijms131114002.

[5] 邵麗. 產胞外多糖乳桿菌的篩選及其多糖的分離、結構和生物活性研究[D]. 無錫: 江南大學, 2015.

[6] 張巖春, 李盛鈺, 羅永康, 等. 產胞外多糖植物乳桿菌C88發酵條件優化[J]. 中國乳品工業, 2010, 38(7): 18-21. DOI:10.3969/ j.issn.1001-2230.2010.07.005.

[7] WANG J, ZHAO X, TIAN Z, et al. Isolation and characterization of exopolysaccharide-producing Lactobacillus plantarum SKT109 from Tibet Kefir[J]. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 2015, 65(4): 269-279. DOI:10.1515/pjfns-2015-0023.

[8] WANG J, ZHAO X, TIAN Z, et al. Characterization of an exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum YW11 isolated from Tibet Kefir[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 125: 16-25. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.03.003.

[9] ZHOU K, ZENG Y T, YANG M L, et al. Production, purification and structural study of an exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum BC-25[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 144(25): 205-214. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.02.067.

[10] 曹永強, 王輯, 趙笑, 等. 植物乳桿菌YW11生產胞外多糖的發酵條件研究[J]. 北京工商大學學報(自然科學版), 2016, 34(1): 42-49. DOI:10.3969/j.issn.2095-6002.2016.01.007.

[11] 艾連中, 郭本恒, 張灝, 等. 干酪乳桿菌LC2W合成胞外多糖培養基成分的優化[J]. 中國乳品工業, 2007, 35(2): 16-18. DOI:10.3969/ j.issn.1001-2230.2007.02.004.

[12] 陳曉燕. 胞外多糖高產乳桿菌的選育及其發酵條件的優化[D].蘭州: 蘭州大學, 2013.

[13] 秦曉萌. 植物乳桿菌胞外多糖的合成研究[D]. 昆明: 昆明理工大學, 2015.

[14] LIU C J, GONG F M, LI X R, et al. Natural populations of lactic acid bacteria in douchi from Yunnan province, China[J]. Journal of Zhejiang University Science B: Biomedicine & Biotechnology 2012, 13(4): 298-306. DOI:10.1631/jzus.B1100221.

[15] 王瑞瓊, 張紅星, 熊利霞, 等. 乳酸菌胞外多糖分離純化方法研究進展[J]. 食品科學, 2008, 29(8): 700-703. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2008.08.172.

[16] KANMANI P, SATISH K R, YUVARAJ N, et al. Production and purification of a novel exoploysaccharide from lactic acid bacterium Streptococcus phocae PI80 and its functional characteristics activity in vitro[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(7): 4827-4833.

[17] 王永菲, 王成國. 響應面法的理論與應用[J]. 中央民族大學學報(自然科學版), 2005, 14(3): 236-240. DOI:10.3969/ j.issn.1005-8036.2005.03.008.

[18] BAJPAI S, GUPTA S K, DEY A, et al. Application of central composite design approach for removal of chromium (Ⅵ) from aqueous solution using weakly anionic resin: modeling, optimization, and study of interactive variables[J]. Journal of Hazardous Materials, 2012, 227: 436-444. DOI:10.1016/j.jhazmat.2012.05.016.

[19] CHANDRA M, BARATA A, LOUREIORO V, et al. A response surface methodology study on the role of factors affecting growth and volatile phenol production by Brettanomyces bruxellensis ISA 2211 in wine[J]. Food Microbiology, 2014, 42(9): 40-46. DOI:10.1016/ j.fm.2014.03.002.

[20] 高慧娟, 劉志芳, 袁成玲, 等. 響應曲面法優化大蓋G9菌絲體干重和胞外粗多糖的發酵條件[J]. 食品科技, 2014, 39(10): 57-62.

[21] BASKAN M B, PALA A. A Statistical experiment design approach for arsenic removal by coagulation process using aluminum sulfate[J]. Desalination, 2010, 254(1/2/3): 42-48. DOI:10.1016/ j.desal.2009.12.016.

[22] JOSHI S R, KOIJAM K. Exopolysaccharide production by a lactic acid bacteria, Leuconostoc lactis isolated from ethnically fermented beverage[J]. Natlonal Academy Science Letters-India, 2014, 37(1): 59-64. DOI:10.1007/s40009-013-0203-6.

[23] CHEIRSILP B, SHIMIZU H, SHIOYA S. Modelling and optimization of environmental conditions for kefiran production by Lactobacillus ke ranofaciens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 57(5/6): 639-646.

[24] DESAIA K M, AKOLKARA S K, BADHEB Y P, et al. Optimization of fermentation media for exopolysaccharide production from Lactobacillus plantarum using artificial intelligence-based techniques[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(8): 1842-1848. DOI:10.1016/j.procbio.2006.03.037.

[25] 紀鵑, 李偉, 陳曉紅, 等. 瑞士乳桿菌MB2-1胞外多糖發酵條件優化[J]. 食品科學, 2014, 35(7): 95-101. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201407020.

[26] 李彥巖, 張彩, 范熠, 等. 一株解淀粉芽孢桿菌產糖條件的優化[J]. 食品科學, 2013, 34(7): 185-189. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201307039.

[27] GHASEMLOU M, KHODAIYAN F, JAHANBIN K, et al. Structural investigation and response surface optimisation for improvement of kefiran production yield from a low-cost culture medium[J]. Food Chemistry, 2012, 133(2): 383-389. DOI:10.1016/ j.foodchem.2012.01.046.

[28] SEESURIYACHAN P, KUNTIYA A, HANMOUNGJAI P, et al. Optimization of exopolysaccharide overproduction by Lactobacillus confusus in solid state fermentation under high salinity stress[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2012, 76(5): 912-917. DOI:10.1271/bbb.110905.

[29] LARPIN S, SAUVAGEOT N, PICHEREAU V, et al. Biosynthesis of exopolysaccharide by a Bacillus licheniformis strain isolated from Ropy Cider[J]. International Journal of Food Microbiology, 2002, 77(1/2): 1-9. DOI:10.1016/S0168-1605(02)00058-2.

[30] van GEEL-SCHUTTEN G H, FLESCH F, SMITH M R, et al. Screening and characterization of Lactobacillus strains producing large amounts of exopolysaccharides[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, 50(6): 697-703.

[31] 張清麗. 酪蛋白活性肽對乳酸菌生長代謝及酸乳發酵影響的研究[D].廣州: 華南理工大學, 2001.

[32] WANG K, LI W, RUI X, et al. Characterization of a novel exopolysaccharide with antitumor activity from Lactobacillus plantarum 70810[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 63: 133-139. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2013.10.036.

[33] 馮美琴, 邢家溧, 張琦, 等. 植物乳桿菌胞外多糖發酵條件的優化[J].食品科學, 2011, 32(23): 215-219.

Optimization of Biosynthesis Conditions for the Production of Exopolysaccharides by Lactobacillus plantarum YM-2

SI Tianzhao, LIU Chenjian, QIN Xiaomeng, LI Xiaoran, LUO Yiyong, YANG En*
(Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

The fermentation conditions for the production of exopolysaccharides (EPS) by Lactobacillus plantarum YM-2, isolated from traditional fermented tempeh in Yunnan province, were optimized. Firstly, the carbon and nitrogen sources in the medium were screened. Secondly, the effects of carbon source concentration, nitrogen source concentration, culture time and culture temperature on EPS yield were studied through one-factor-at-a-time analysis. Finally, response surface methodology (RSM) based on a four-variable, three-level Box-Behnken design was used to determine the optimal culture conditions as follows: carbon source concentration, 30 g/L; nitrogen s ource concentration, 30 g/L; culture time, 30.05 h; and culture temperature, 36.36 ℃. Under these conditions, the yield of EPS was 257.362 mg/L.

Lactobacillus plantarum; exopolysaccharides (EPS); optimization; response surface methodology (RSM)

10.7506/spkx1002-6630-201710005

TS201.3

A

1002-6630（2017）10-0024-07

司天昭, 柳陳堅, 秦曉萌, 等. 植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優化[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 24-30.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710005. http://www.spkx.net.cn

SI Tianzhao, LIU Chenjian, QIN Xiaomeng, et al. Optimization of biosynthesis conditions for the production of exopolysaccharides by Lactobacillus plantarum YM-2[J]. Food Science, 2017, 38(10): 24-30. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710005. http://www.spkx.net.cn

2016-07-06

國家自然科學基金地區科學基金項目（31560447）

司天昭（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：xizhao_si@126.com

*通信作者：楊恩（1982—），女，講師，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：enen_yang@126.com