碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌碳青霉烯及頭孢菌素類抗生素耐藥機制

孫恒彪，陳佑明，尤 旭，潘祖漢，肖 剛，明 月

(1 南方醫科大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510630； 2 南方醫科大學檢驗系，廣東 廣州 510630)

·論著·

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌碳青霉烯及頭孢菌素類抗生素耐藥機制

孫恒彪1，陳佑明1，尤 旭1，潘祖漢1，肖 剛1，明 月2

(1 南方醫科大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510630； 2 南方醫科大學檢驗系，廣東 廣州 510630)

目的 研究碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(CRE)對碳青霉烯及頭孢菌素類抗生素耐藥機制，為臨床治療CRE感染及醫院感染的控制提供分子流行病學依據。方法 收集2014—2015年臨床送檢各類標本分離的細菌，使用Microscan Walkaway 40 plus進行細菌鑒定和藥敏試驗，對分離的CRE進行常見碳青霉烯酶的編碼基因(blaNDM-1及blaKPC-2)和超廣譜β-內酰胺酶編碼基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1-like、blaCTX-M-2-like、blaCTX-M-8-like及blaCTX-M-9-like)的檢測，同時檢測細菌多重耐藥相關的I類整合子編碼基因blainT-1。結果 2014—2015年共分離7株CRE，檢出率為0.30%，1～6號菌株為肺炎克雷伯菌，7號菌株為弗勞地檸檬酸桿菌，7株菌株對β-內酰胺酶抑制劑復合制劑、頭孢菌素類、頭霉素類、碳青霉烯類抗生素均耐藥，3株菌對阿米卡星及四環素敏感，2株菌對復方磺胺甲口惡唑敏感。3株菌檢出blaNDM-1，2株檢出blaKPC-2，5株檢出blaTEM，7株均可檢出blaSHV，1株檢出blaCTX-M-1-like，4株檢出blaCTX-M-9-like，5株檢出blainT-1，未檢出基因blaCTX-M-2-like及blaCTX-M-8-like。結論blaNDM-1及blaKPC-2是導致7株CRE對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機制，blaTEM、blaSHV及blaCTX-M-9-like是導致對頭孢菌素類抗生素耐藥的主要原因，blainT-1在CRE多重耐藥及耐藥基因傳播中發揮著巨大的作用。

碳青霉烯類耐藥； 腸桿菌科細菌； 頭孢菌素； 碳青霉烯酶； 碳青霉烯類抗生素； 多重耐藥； CRE

[Chin J Infect Control，2017，16(5)：404-408]

腸桿菌科細菌廣泛存在于自然環境中，是人類腸道定植的最大一類正常菌群，同時也是臨床最常見的病原菌，當腸道內菌群因外傷、機體免疫力下降、侵入性操作等出現移位時，可引起皮膚傷口感染、肺炎、泌尿系統感染、血流感染等。頭孢菌素類抗生素是用于治療腸桿菌科細菌感染的常用藥物，產超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)是導致腸桿菌科細菌對頭孢菌素類抗生素耐藥的主要機制[1]。碳青霉烯類抗生素是治療腸桿菌科細菌重癥感染的一線抗菌藥物，但近年來出現了產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌，這類細菌往往對包括碳青霉烯類在內的多種不同類型抗菌藥物耐藥，從而導致臨床治療失敗，嚴重威脅患者生命[2-3]。本文通過對2014—2015年分離到的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem - resistant Enterobacteriaceae, CRE)的ESBLs、碳青霉烯酶、I類整合子檢測，了解CRE對頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素耐藥機制和整合子在CRE中攜帶情況，為CRE的臨床治療及醫院感染控制提供分子流行病學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014—2015年門診及住院患者送檢各類標本按照《全國臨床檢驗操作規程》對送檢培養標本進行細菌培養及抗菌藥物敏感性試驗，收集分離的CRE。

1.2 菌株鑒定及藥敏試驗 使用MicroScan Walkaway 40 plus全自動微生物鑒定藥敏分析儀對分離菌株進行鑒定和藥物敏感性分析。參考美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2014年版進行抗菌藥物敏感性判定。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、銅綠假單胞菌 ATCC 27853，均購自廣東省臨床檢驗中心。

1.3 CRE判定標準 腸桿菌科細菌對亞胺培南、厄他培南及美羅培南中任何一種藥物耐藥即判定為CRE，所有CRE均采用K-B法對這3種藥物進行復核。

1.4 模板DNA提取 采用煮沸法提取細菌基因組全部DNA，挑取經分純培養過夜菌株至雙蒸水中，100℃加熱煮沸15 min，冷卻至室溫后13 000 rpm離心10 min，取上清液作為PCR反應模板，-20℃保存備用。

1.5 引物設計 登錄GenBank查找全基因組堿基序列，使用Primer premier 5.0版軟件設計引物。引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。引物見表1。

表1 9種耐藥基因引物序列

1.6 基因檢測 9種耐藥基因反應體系均為：總體積20 μL，其中2×PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，模板2 μL，雙蒸水6.8 μL。blaNDM-1、blaKPC-2、blaTEM、blaSHV及blainT-1PCR反應條件為：94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s， 30個循環，最后72℃延伸5 min。blaCTX-M-1-like、blaCTX-M-2-like、blaCTX-M-8-like及blaCTX-M-9-like PCR反應的退火為61℃，其他反應條件與上述基因PCR反應條件相同。PCR擴增產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統拍照。

2 結果

2.1 藥敏結果 2014—2015年共分離到腸桿菌科細菌2 315株，其中7株為CRE，檢出率為0.30%。1～6號CRE為肺炎克雷伯菌，7號菌株為弗勞地檸檬酸桿菌，7株菌對β-內酰胺酶抑制劑復合制劑、頭孢菌素類、頭霉素類、碳青霉烯類均耐藥，3株菌對阿米卡星及四環素敏感，2株菌對復方磺胺甲口惡唑敏感，1株菌對氨曲南敏感。

2.2 耐藥基因檢測結果 3株菌檢出blaNDM-1，2株檢出blaKPC-2，5株可檢出blaTEM，7株均可檢出blaSHV，1株檢出blaCTX-M-1-like，4株檢出blaCTX-M-9-like，5株檢出blainT-1，未檢出耐藥基因blaCTX-M-2-like和blaCTX-M-8-like。見圖1～2及表2。

M： Marker; 1-7:為1-7號CRE菌株

M： Marker; 1-7:為1-7號CRE菌株

Table 2 Detection results of drug-resistant genes of 7 CRE strains

耐藥基因菌株1號2號3號4號5號6號7號blaNDM-1++----+blaKPC-2--+--+blainT-1++-++-+blaTEM--+++++blaSHV+++++++blaCTX-M-1-like------+blaCTX-M-2-like-------blaCTX-M-8-like-------blaCTX-M-9-like+++--+-

+：檢出；-：未檢出

3 討論

近年來碳青霉烯類抗生素在臨床的使用量不斷增加，這可能是導致CRE產生的原因之一，2014年中國細菌耐藥監測網(CHINET)數據顯示，35 788株腸桿菌科細菌對亞胺培南、美羅培南及厄他培南耐藥率均超過5%[4]。腸桿菌科多個種屬可檢出CRE，常見CRE有肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、變形桿菌屬、弗勞地檸檬酸桿菌等[5-6]。

該院2014—2015年共分離7株CRE，其中6株為肺炎克雷伯菌，1株為弗勞地檸檬酸桿菌。4株CRE分離自重癥監護病房(ICU)，2株分離自神經外科，1株分離自心內科。5株分離自痰標本，2株分離自尿標本，7株CRE來源患者均存在嚴重的原發性疾病，如腦出血、顱腦外傷、嚴重的心血管疾病等，且長期接受廣譜抗菌藥物治療，說明CRE可引起呼吸系統及泌尿系統感染，嚴重的原發疾病及廣譜抗菌藥物的使用是CRE感染的重要危險因素，與文獻[7]報道一致。耐藥數據顯示，7株CRE對β-內酰胺酶抑制劑復合制劑、頭孢菌素類、頭霉素類、碳青霉烯類抗生素均耐藥，分別有3株菌對阿米卡星及四環素敏感，提示CRE存在著復雜的耐藥機制。

腸桿菌科細菌產ESBLs在各個國家地區均有報道，是細菌對頭孢菌素類抗生素耐藥的重要機制之一。ESBLs主要分為blaTEM、blaSHV、blaCTX-M，其中blaCTX-M根據同源性可分為多個家族，主要包括blaCTX-M-1-like、blaCTX-M-2-like、blaCTX-M-8-like及blaCTX-M-9-like[8]。細菌對碳青霉烯類抗生素主要耐藥機制為產碳青霉烯酶，Ambler分類中的A、B、D類酶可水解碳青霉烯類抗生素，其中A類酶主要有GES、KPC、SME等，B類為金屬酶，可被EDTA抑制，主要包括VIM、IMP、AIM、SIM、NDM-1等，D類酶即苯唑西林酶，其中的OXA-48對碳青霉烯類抗生素耐藥發揮著巨大的作用[9-10]。攜帶有blaKPC-2的細菌對包括碳青霉烯類在內的所有β-內酰胺類抗生素耐藥，同時因blaKPC-2位于可轉移的耐藥質粒上，極易導致blaKPC-2在不同細菌間傳播，從而引起CRE醫院感染的流行[11-12]。自2009年耐藥基因blaNDM-1首次被報道以來，關于blaNDM-1的報道逐年增加，blaNDM-1編碼的產物不但可以水解碳青霉烯類抗生素，也可水解多數頭孢菌素類抗生素，攜帶有blaNDM-1的細菌往往同時攜帶有針對氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物耐藥基因，從而進一步加劇細菌的耐藥性[13]。I類整合子是一類可主動獲取耐藥基因的可移動元件，在多種革蘭陰性桿菌中均有檢出，與細菌多重耐藥性及耐藥基因傳播有著密切的關系[14]。本研究中1號及2號菌株同時攜帶有blaNDM-1、blaSHV、blaCTX-M-9-like及blainT-1，3號及6號菌株同時攜帶有blaKPC-2、blaTEM、blaSHV及blaCTX-M-9-like，4號及5號菌株同時攜帶有blaTEM、blaSHV及blainT-1，7號菌株同時攜帶有blaNDM-1、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1-like及blainT-1，每株菌至少可檢出2種ESBLs相關耐藥基因，多株菌同時檢出ESBLs相關耐藥基因及blaNDM-1或blaKPC-2，說明攜帶有ESBLs相關耐藥基因是7株CRE對頭孢菌素類抗生素耐藥的主要原因，同時也說明了多種耐藥機制參與了頭孢菌素類抗生素的耐藥性；攜帶blaNDM-1及blaKPC-2是CRE對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制。4號及5號未檢出blaNDM-1及blaKPC-2，可能是blaVIM、blaOXA-48等其他碳青霉烯耐藥基因介導了對碳青霉烯類抗生素耐藥[15]。7株CRE中部分菌株對氨基糖苷類、復方磺胺甲口惡唑及四環素耐藥，因本研究主要了解CRE對頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素的耐藥機制，故未檢測關耐藥。

綜上所述，CRE耐藥形勢嚴峻，結合本文耐藥統計數據及文獻報道，CRE感染治療建議使用氨基糖苷類、四環素類如替加環素、多粘菌素、磷霉素等抗菌藥物，美羅培南、多粘菌素及替加環素聯合治療可明顯降低病死率[16]。多種不同耐藥機制介導了CRE對頭孢菌素類抗生素的耐藥，對碳青霉烯類抗生素耐藥主要機制為攜帶blaNDM-1及blaKPC-2。臨床科室及醫院感染控制部門應密切監控攜帶有碳青霉烯酶相關耐藥基因及I類整合子的CRE，做好感染患者隔離工作，避免CRE在醫院內暴發流行。

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(本文編輯：豆清婭)

Resistance mechanisms of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae to carbapenems and cephalosporins

SUNHeng-biao1,CHENYou-ming1,YOUXu1,PANZu-han1,XIAOGang1,MINGYue2

(1TheThirdAffiliatedHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510630,China; 2DepartmentofClinicalLaboratory,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510630,China)

Objective To study the resistance mechanisms of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae(CRE) to carbapenems and cephalosporins, and provide molecular evidence for the treatment of CRE infection and control of healthcare-associated infection.Methods Clinically isolated bacteria in 2014-2015 were identified and performed antimicrobial susceptibility testing by MicroScan Walkaway-40 plus system, encoding genes of carbapenems(blaNDM-1andblaKPC-2) and encoding genes of extended-spectrum β-lactamases (blaTEM,blaSHV,blaCTX-M-1-like,blaCTX-M-2-like,blaCTX-M-8-like, andblaCTX-M-9-like)were detected, multidrug-resistance organism-related class I integron encoding geneblainT-1was also detected. Results Seven CRE strains were isolated in 2014-2015, isolation rate was 0.30%, strain 1-6 wasKlebsiellapneumoniae, strains 7 wasCitrobacterfreundii, all 7 strains were resistant to β-lactamase inhibitor compound, cephalosporins, cephamicins, and carbapenems, 3 strains were sensitive to amikacin and tetracycline, 2 strains were sensitive to compound sulfamethoxazole. 3, 2, 5, 7, 1, 4, and 5 strains of CRE were detected carryingblaNDM-1，blaKPC-2，blaTEM，blaSHV，blaCTX-M-1-like，blaCTX-M-9-like，andblainT-1respectively, no strain was found to carryblaCTX-M-2-like andblaCTX-M-8-like genes. ConclusionblaNDM-1andblaKPC-2are important mechanisms leading to carbapenem resistance of 7 CRE strains;blaTEM,blaSHV, andblaCTX-M-9-like are important mechanism leading to cephalosporin resistance,blainT-1plays an important role in multidrug-resistance to CRE and spread of multidrug-resistant genes.

carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; Enterobacteriaceae; cephalosporin; carbapenemase; carbapenems; multidrug resistance; CRE

2016-06-05

孫恒彪(1986-)，男(漢族)，陜西省咸陽市人，主管技師，主要從事細菌耐藥機制研究。

陳佑明 E-mail:cym38432@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.05.003

R378

A

1671-9638(2017)05-0404-05