白假絲酵母菌基因分型方法的研究進(jìn)展

肖 喻(XIAO Yu) , 曹先偉(CAO Xian-wei)

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

(The First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006， China)

·綜述·

白假絲酵母菌基因分型方法的研究進(jìn)展

肖 喻(XIAO Yu) , 曹先偉(CAO Xian-wei)

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

(The First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006， China)

真菌；白假絲酵母菌；基因分型；流行病學(xué)

Advances in genotyping methods ofCandidaalbicans

隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，各種醫(yī)用材料和侵入性操作技術(shù)在臨床廣泛應(yīng)用，廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑在臨床的大量使用，醫(yī)院內(nèi)真菌感染的比例越來(lái)越高，其中白假絲酵母菌在真菌感染中所占比例最高，是臨床中常見(jiàn)的致病菌之一。白假絲酵母菌主要引起皮膚、黏膜的淺表部位感染，侵襲性呼吸系統(tǒng)感染和血流感染等，其中血流感染相對(duì)嚴(yán)重，如白假絲酵母菌血癥。早在二十世紀(jì)八十年代，Pfaller等[1]報(bào)道，侵襲性假絲酵母菌感染的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視。近十幾年，假絲酵母菌在美國(guó)和歐洲引起醫(yī)院感染的致病菌中分別占第四位和第六位[2]。在亞洲假絲酵母菌引起醫(yī)院感染的發(fā)病率也相對(duì)較高[3]。盡管有較多抗真菌藥物可以用來(lái)治療侵襲性假絲酵母菌感染，但其病死率仍然在30%左右[2-3]。利用分子生物學(xué)的方法，可以對(duì)假絲酵母菌進(jìn)行同源性分析和查找傳播途徑。從而為制定預(yù)防和控制假絲酵母菌醫(yī)院感染流行、傳播的有效措施提供理論依據(jù)。

二十世紀(jì)，白假絲酵母菌的分型方法主要是根據(jù)白假絲酵母菌菌落形態(tài)和藥物敏感性進(jìn)行分類，如形態(tài)型分型、血清型分型和耐藥性分型[4]。而上述分型方法分辨率低，可重復(fù)性差，而且分型結(jié)果很容易受到外界環(huán)境的影響，因此不能作為白假絲酵母菌分型的標(biāo)準(zhǔn)方法。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)在白假絲酵母菌的分型、診斷及流行病學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。白假絲酵母菌流行病學(xué)研究中常用的基因分型方法主要有多位點(diǎn)酶電泳(multilocus enzyme electrophoresis， MLEE)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphim，RFLP)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis， PFGE)、微衛(wèi)星長(zhǎng)度多態(tài)性(microsatellite length polymorphic，MLP)和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)。本文將對(duì)此7種基因分型方法進(jìn)行綜述。

1 MLEE分型

MLEE是從“一酶一基因”的學(xué)說(shuō)發(fā)展起來(lái)的，早在二十世紀(jì)六十年代就已經(jīng)提出，1985年Selander對(duì)MLEE改進(jìn)后用于病原微生物的分型研究。MLEE主要通過(guò)檢測(cè)病原微生物的水溶性代謝酶，從而對(duì)菌株進(jìn)行分型。MLEE 是檢測(cè)酶蛋白的多態(tài)性來(lái)反映基因位點(diǎn)的多態(tài)性。酶蛋白的泳動(dòng)度主要是由蛋白的分子結(jié)構(gòu)及其所帶電荷決定，而編碼酶蛋白DNA序列中的任意一個(gè)堿基發(fā)生變化(主要為堿基的替換、插入、刪除)均可能導(dǎo)致酶蛋白的泳動(dòng)度發(fā)生變化。當(dāng)兩株菌的酶蛋白泳動(dòng)度不同時(shí)，可認(rèn)為其DNA序列不同，從而對(duì)菌株進(jìn)行基因分型[5]。

MLEE是最早用于白假絲酵母菌流行病學(xué)研究的基因分型方法。Pujol等[6]首次用MLEE方法對(duì)白假絲酵母菌的菌群分布進(jìn)行了研究，此后，MLEE逐漸被用于其他假絲酵母菌的流行病學(xué)研究，如熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌等[7]。MLEE是一種分辨率一般但重復(fù)性較好的基因分型方法，重復(fù)性甚至優(yōu)于以DNA為基礎(chǔ)的其他基因分型方法[5，8]。但是，MLEE不能直接分析白假絲酵母菌的全基因組，且操作耗時(shí)較長(zhǎng)。另外，MLEE不能檢測(cè)基因的全部序列，特別是堿基發(fā)生變化時(shí)未引起氨基酸和蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的基因序列。單一的酶切使得MLEE在檢測(cè)白假絲酵母菌時(shí)并不敏感，但聯(lián)合多個(gè)酶切位點(diǎn)可提高M(jìn)LEE的敏感性。Boriollo等[5]聯(lián)合11個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示多個(gè)酶切位點(diǎn)聯(lián)合方法可明顯提高M(jìn)LEE的敏感性，可準(zhǔn)確地對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型。因此，MLEE至今仍然是白假絲酵母菌分子流行病學(xué)研究中的重要分型方法。

2 RAPD分型

RAPD是由Williams等提出的一種以隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈(通常不超過(guò)10 bp)為引物擴(kuò)增基因組DNA的基因分型方法。該技術(shù)以PCR方法為基礎(chǔ)，由一系列人工隨機(jī)合成的寡聚核苷酸單鏈為引物，對(duì)堿基組進(jìn)行單引物擴(kuò)增。擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后通過(guò)EB染色或放射自顯影檢測(cè)，從而觀察待測(cè)DNA的多態(tài)性。這些擴(kuò)增片段DNA的多態(tài)性主要由瓊脂糖凝膠上條帶的數(shù)量和位置決定。因此，當(dāng)不相關(guān)菌株的基因差異較大時(shí)，RAPD將呈現(xiàn)出較復(fù)雜的結(jié)果。目前，RAPD已經(jīng)在假絲酵母菌屬和其他真菌的分型中得到廣泛運(yùn)用，如白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、煙曲霉等[9-10]。RAPD廣泛用于菌株分型的原因主要是操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、成本低、引物可以隨意設(shè)計(jì)，而且不需要知道待測(cè)DNA的堿基序列[9]。但是，RAPD的分辨率一般，研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，RAPD和MLEE的結(jié)果有很高的相似性。若研究者要得到分辨率較高的結(jié)果，需設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增[5]。RAPD可對(duì)不相關(guān)的、集群相關(guān)的、相同或相關(guān)的白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，即RAPD適合所有白假絲酵母菌的流行病學(xué)研究[9]。

盡管RAPD在白假絲酵母菌流行病學(xué)研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但是仍然存在2個(gè)不足之處，即重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性差。由于該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和設(shè)備要求不高[9]，仍廣泛應(yīng)用于假絲酵母菌屬的基因分型研究。 Biernasiuk等[11]用RAPD方法對(duì)100例非小細(xì)胞肺癌患者上呼吸道分泌物中分離的白假絲酵母菌進(jìn)行分型， 52株白假絲酵母菌可分為34個(gè)基因型，其中28株白假絲酵母菌有10個(gè)基因型，且相似度高達(dá)80%以上，其余的24株白假絲酵母菌有24個(gè)基因型。該研究顯示RAPD可對(duì)癌癥患者上呼吸道分離的白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，因此，RAPD仍被廣泛用于白假絲酵母菌的診斷及流行病學(xué)的研究。

3 AFLP分型

AFLP是二十世紀(jì)九十年代由Zabean等發(fā)展起來(lái)的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)。該方法主要是通過(guò)使用2種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行酶切，然后將人工合成的特異雙鏈接頭連接在這些片段的兩端，形成一個(gè)帶接頭的特異片段，用這些特異片段作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，通過(guò)接頭序列與引物3’一端的熒光標(biāo)記識(shí)別，然后對(duì)特異性片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后對(duì)電泳的條帶進(jìn)行分析，進(jìn)而得到待測(cè)標(biāo)本的基因型。

AFLP是一種具有多位點(diǎn)標(biāo)記和高分辨率的基因分型方法。該方法不需要了解待測(cè)標(biāo)本的基因序列。AFLP基因分型方法需要熒光標(biāo)記的引物，并且實(shí)驗(yàn)條件也較嚴(yán)格[12]，因此AFLP的重復(fù)性比RAPD好。

盡管AFLP是一種分辨率高且重復(fù)性好的基因分型方法，但是因?yàn)樵摲椒ú僮鬏^繁瑣，成本高，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)要求較為嚴(yán)格[12-13]。因此，在白假絲酵母菌的流行病學(xué)研究中使用較少。

4 RFLP分型

RFLP是由Kan等在1978年提出的一種方法，用不同的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)檢測(cè)的DNA進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切后DNA片段的分子量和長(zhǎng)度推斷DNA酶切位點(diǎn)數(shù)目和位置的差異，進(jìn)而對(duì)菌株進(jìn)行基因分型。目前，白假絲酵母菌進(jìn)行RFLP分型常用的兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶為EcoR Ⅰ 和Msp Ⅰ。 EcoR Ⅰ酶切和Msp Ⅰ酶切后均可以產(chǎn)生6個(gè)基因型，兩者聯(lián)合酶切后可以產(chǎn)生17個(gè)基因型。RFLP分型方法分辨力低但重復(fù)性好，容易操作，耗時(shí)少；但不能單獨(dú)用來(lái)分析白假絲酵母菌菌種間的基因型關(guān)系。Ge等[12]用RFLP方法對(duì)42株白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，共分為1個(gè)基因型，該研究顯示單獨(dú)應(yīng)用RFLP不能較好地分析白假絲酵母菌基因型。有學(xué)者應(yīng)用RFLP聯(lián)合其他方法對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合后可以提高RFLP對(duì)白假絲酵母菌的分型能力，因此，此種RFLP聯(lián)合方法在白假絲酵母菌的基因分型中可推廣應(yīng)用[12,14]。

5 PFGE分型

PFGE是1984年由Schwartz等報(bào)道的一種以DNA為基礎(chǔ)的基因分型方法，并用該方法首次成功分析了釀酒酵母菌的全基因組。PFGE是通過(guò)改變脈沖電場(chǎng)的方向、時(shí)間和電流，使不同大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠上不斷改變移動(dòng)方向。隨著電場(chǎng)方向變化，小的 DNA 分子比大的變化快,從而根據(jù)分子量的大小區(qū)分不同DNA片段，最后根據(jù)電泳帶型對(duì)菌株進(jìn)行基因分型。PFGE分型首先是用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋細(xì)菌染色體DNA，在整個(gè)包埋過(guò)程中低熔點(diǎn)瓊脂糖需阻止機(jī)械力對(duì)DNA的剪切作用，然后將蛋白酶和洗滌劑加入樣品中進(jìn)行水解，再根據(jù)待測(cè)DNA分子量的差異，使其在瓊脂糖凝膠不同位置上出現(xiàn)條帶，再對(duì)這些條帶進(jìn)行綜合分析，根據(jù)條帶類型確定菌株的基因型。PFGE是一種容易操作，且重復(fù)性較好的基因分型方法。但由于該方法的實(shí)驗(yàn)成本高，耗時(shí)較長(zhǎng)，且需要專門(mén)的儀器設(shè)備，臨床研究中使用相對(duì)較少[5,7]。白假絲酵母菌染色體DNA分子量大小為1～4 Mb，PFGE對(duì)此范圍的DNA片段相對(duì)敏感。1987年Magee用PFGE方法對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，此后越來(lái)越多的學(xué)者用PFGE方法研究白假絲酵母菌的流行病學(xué)，但該方法分辨力一般[5,15]。有學(xué)者運(yùn)用PFGE聯(lián)合其他基因分型方法對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行分型，可以明顯提高基因分型的分辨率。Boriollo聯(lián)合運(yùn)用MLEE、PFGE和MLP三種分型方法對(duì)75株白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，MLEE基因分型方法的同工酶包括以下11種：adh、sdh、mip、mdh、idh、gdh、g6pdh、asd、cat、po和lap；PFGE用CHEF系統(tǒng)對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型；MLP用3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(EF3、CDC3和HIS3)對(duì)白假絲酵母進(jìn)行基因分型，3種基因型分型方法的分辨力均高達(dá)95%，可較好的分辨DNA片段差異性，聯(lián)合運(yùn)用此3種基因分型方法可明顯提高分辨力[5]。因此，PFGE常與其他基因分型方法聯(lián)合用于假絲酵母菌的流行病學(xué)研究。

6 MLP分型

MLP又被稱為短串聯(lián)序列。MLP是一種根據(jù)少數(shù)幾個(gè)脫氧寡核苷酸(多數(shù)為2～6個(gè))為單位進(jìn)行多次DNA序列串聯(lián)重復(fù)的微生物分型方法[16]。MLP的檢測(cè)主要利用PCR方法，微衛(wèi)星的標(biāo)記物主要由側(cè)翼序列和標(biāo)記引物共同構(gòu)成。人工合成微衛(wèi)星標(biāo)記引物的引物序列，然后通過(guò)引物序列對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙酰胺凝膠進(jìn)行電泳，染色后對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。微衛(wèi)星的標(biāo)記引物主要由熒光和同位素組成，通過(guò)電泳成像后可以觀察PCR擴(kuò)增之后的目的片段大小，從而分析目的片段的多態(tài)性。若是無(wú)熒光標(biāo)記的引物可通過(guò)銀染顯色觀察結(jié)果[17]。隨著二代測(cè)序的推廣，目的片段可監(jiān)測(cè)其片段重復(fù)數(shù)。對(duì)于二倍體生物，如白假絲酵母菌，當(dāng)重復(fù)數(shù)較單一時(shí)，表示該生物為純合子；相反，如果重復(fù)數(shù)較復(fù)雜時(shí)，顯示該生物為雜合子[16]。Sampaio等[17]在2005年首次用此技術(shù)對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型研究。

MLP在白假絲酵母菌的分型研究中有較高的分辨率[17]。但是，該方法分辨率的高低與微衛(wèi)星標(biāo)記物的選擇有關(guān)。目前，已有文獻(xiàn)[4]報(bào)道白假絲酵母菌的微衛(wèi)星標(biāo)記物主要有EF3、CDC3、HIS3、ERK1、2NF1、CCN2、CPH2、EFG1、CAI、CAIII和CAVIII。上述微衛(wèi)星標(biāo)記物的分辨率在0.57～0.97(CAI)之間[16-17]。微衛(wèi)星標(biāo)記物的選取主要依據(jù)標(biāo)記物的分型性能、突變率和分辨率三個(gè)方面。兩種或三種微衛(wèi)星標(biāo)記物聯(lián)合可以明顯提高分辨率。Botterel等[18]聯(lián)合使用EF3、CDC3和HIS3三種微衛(wèi)星標(biāo)記物對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行分型，聯(lián)合后的分辨率高達(dá)0.97。目前，已報(bào)道的文獻(xiàn)中分辨率最高的組合是Sampaio等[17]聯(lián)合使用的CAI、CAIII和CAVI組合，其分辨率高達(dá)0.998。有學(xué)者利用高分辨率的熔解曲線技術(shù)和MLP對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，可明顯提高M(jìn)LP的分辨率[15,19]。

MLP分型與其他的基因分型方法相比，更適合多樣本分析[17-18]。該方法重復(fù)性好，但由于實(shí)驗(yàn)室之間的設(shè)備存在較大差異，數(shù)據(jù)交流不方便[19]。

MLP廣泛應(yīng)用于白假絲酵母菌、煙曲霉菌和隱球菌的流行病學(xué)研究，但其實(shí)驗(yàn)設(shè)備的費(fèi)用較高[19-20]。為盡量降低實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)費(fèi)用，我國(guó)學(xué)者采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性和微衛(wèi)星標(biāo)記物CAI聯(lián)合對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，分辨率高達(dá)0.993[20]，實(shí)驗(yàn)成本低，易推廣應(yīng)用。

7 MLST分型

MLST是由Maiden在1998年提出的通過(guò)分析6～10個(gè)管家基因(400～500 bp)核苷酸序列的多態(tài)性，對(duì)致病微生物進(jìn)行基因分型的一種方法。MLST選擇的管家基因均相對(duì)保守，受環(huán)境因素影響較小，其次可以得到多個(gè)等位基因分型。在每個(gè)管家基因中，不同的堿基序列可認(rèn)為是不同的等位基因。MLST主要是通過(guò)設(shè)計(jì)管家基因引物，運(yùn)用PCR方法對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到待測(cè)菌株的管家基因片段。每個(gè)管家基因片段對(duì)應(yīng)一個(gè)等位基因，每株菌的多位點(diǎn)序列分型是由多個(gè)等位基因共同得到的一個(gè)序列型(ST)。由于白假絲酵母菌為二倍體生物，在MLST的核苷酸分型時(shí)可出現(xiàn)同一位點(diǎn)的雜合性(同一位點(diǎn)出現(xiàn)2個(gè)堿基)，因此Bougnoux等[21]將白假絲酵母菌的MLST分型結(jié)果定義為二倍體序列型(DSTs)。

二十世紀(jì)，MLST首次用于白假絲酵母菌的基因分型，隨著白假絲酵母菌MLST方法的不斷改進(jìn)，2003年Bougnoux提出了白假絲酵母菌MLST的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案，且創(chuàng)建了白假絲酵母菌的MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://calbicans.mlst.net/.)。該數(shù)據(jù)庫(kù)為全球公用數(shù)據(jù)庫(kù)，可隨時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中白假絲酵母菌MLST信息進(jìn)行更新[21]，不僅有利于全球白假絲酵母菌的信息交流，而且有利于研究全球白假絲酵母菌的流行病學(xué)和微進(jìn)化關(guān)系[22]。已有學(xué)者利用白假絲酵母菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了大樣本的流行病學(xué)研究[22-23]。為了解某教學(xué)醫(yī)院白假絲酵母菌基因多態(tài)性，中國(guó)學(xué)者收集40例白假絲酵母菌感染患者分離的62株白假絲酵母菌，經(jīng)過(guò)7個(gè)管家基因擴(kuò)增后，共獲到50個(gè)二倍體序列型，其中有41個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的二倍體序列型[23]。

在白假絲酵母菌的MLST分型研究中，通過(guò)分析7個(gè)管家基因?qū)攴中停?個(gè)管家基因的分子量相對(duì)白假絲酵母菌全基因組則非常小，管家基因主要集中在第3、5和7號(hào)染色體上，因此MLST基因分型方法不夠準(zhǔn)確[4]。但是，與其他分型方法相比，該方法省時(shí)，便于操作，且分辨率和重復(fù)性都較好[17，22-23]，實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)交流方便。因此，越來(lái)越多的學(xué)者用MLST方法研究白假絲酵母菌的流行病學(xué)和微進(jìn)化關(guān)系。

7種基因分型方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 7種白假絲酵母菌基因分型方法優(yōu)缺點(diǎn)

8 結(jié)論與展望

綜上所述，7種白假絲酵母菌基因分型方法均可有效地、準(zhǔn)確地研究白假絲酵母菌的流行病學(xué)和微進(jìn)化關(guān)系，可為臨床疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。隨著基因測(cè)序的飛速發(fā)展，白假絲酵母菌的基因分型方法將逐漸完善，更加精準(zhǔn)。

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(本文編輯：孟秀娟)

2016-07-25

肖喻(1990-)，男(漢族)，湖北省荊州市人，碩士研究生，主要從事真菌感染相關(guān)的研究。

曹先偉 E-mail：ndyfyygk@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.05.021

R379.4

A

1671-9638(2017)05-0482-05