食管鱗癌細胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修復相關因子的表達*

趙曉靜，馬 軍#，袁 翎，王昆侖，李 南，張中冕，孫 佳

1)鄭州大學第二附屬醫院消化內科 鄭州 450014 2)鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南省腫瘤醫院放療科 鄭州 450014 3)鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科 鄭州 450014

食管鱗癌細胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修復相關因子的表達*

趙曉靜1)，馬 軍1)#，袁 翎2)，王昆侖2)，李 南3)，張中冕3)，孫 佳3)

1)鄭州大學第二附屬醫院消化內科 鄭州 450014 2)鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南省腫瘤醫院放療科 鄭州 450014 3)鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科 鄭州 450014

#通信作者，男，1966年8月生，博士，副教授，研究方向：消化道腫瘤，E-mail:843093451@qq.com

食管癌；miR-126；miR-21；miR-101；DNA-PKcs；RAD21；放射照射

目的：探討食管鱗癌細胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修復相關因子表達的關系。方法：采用實時定量PCR檢測不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)X射線照射后TE7中miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA及RAD21 mRNA的表達，蛋白免疫印跡法檢測DNA-PKcs和RAD21蛋白的表達。 結果：X射線照射后，隨吸收劑量的增加，TE7中miR-126表達逐漸升高(P<0.05)，miR-101表達降低(P<0.05)，DNA-PKcs和RAD21 mRNA表達逐漸升高(P<0.05)；磷酸化DNA-PKcs、總DNA-PKcs及RAD21蛋白表達無明顯變化(P>0.05)。當吸收劑量是4 Gy時，TE7細胞中miR-126、miR-101與RAD21蛋白表達呈負相關(r分別為-0.899、-0.853，P均<0.05)。結論：miR-126及miR-101可能通過調節RAD21的表達影響TE7細胞的放療敏感性。

食管癌死亡率位于所有腫瘤的第6位，5 a生存率小于20%[1]。放療是進展期食管癌主要的治療方法，其主要通過誘導DNA雙鏈斷裂來殺傷細胞，而DNA雙鏈斷裂的修復通常導致治療失敗，抑制DNA損傷修復可提高癌細胞的放療敏感性[2]。DNA 雙鏈斷裂修復主要有非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重組(homologous recombination repair,HRR)兩條途徑。DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)是哺乳動物細胞中參與NHEJ的主要分子之一，由Ku70、Ku80、DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)3個亞基組成，其中DNA-PKcs是中心因子，在DNA斷裂修復中起著重要作用[3-4]。RAD21是凝集復合體的一個組分，凝集復合體參與姐妹染色單體的結合、DNA雙鏈斷裂的修復及細胞周期的調控[5]。RAD21可以直接或間接地促進HRR[6]。microRNA(miRNA)作為一種內源性小單鏈非編碼RNA，一般包含18～25個核苷酸，其主要通過與RNA介導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結合形成非對稱的復合物，再與靶基因mRNA的3’-非編碼區域(UTR)結合，從降解靶基因mRNA或者抑制靶基因轉錄后翻譯的角度調控靶基因的表達[7-9]，其參與許多生理和病理性進程，包括放療相關的信號通路[10]。作者用X射線照射食管鱗癌細胞系TE7，觀察照射前后DNA修復相關因子DNA-PKcs、RAD21以及miR-101、miR-21、miR-126表達的變化，探討miRNAs與TE7放療敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及分組處理 TE7細胞由課題組實驗室保存，用6 cm培養皿，含體積分數10%新生牛血清、青鏈霉素(各100 U/mL)的RPMI 1640培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。細胞生長至對數期時，分5組進行X射線(瑞典醫科達公司直線加速器，型號：Synergy,速率2 Gy/min)照射，吸收劑量分別為0、2、4、6和8 Gy，照射24 h后進行指標檢測。每個指標重復檢測3次。

1.2 細胞中mRNAs和miRNAs的檢測 采用Trizol法(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察完整性。miRNAs引物購于GenePharma公司，mRNAs引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。根據Thermo Scientific試劑盒說明書進行反轉錄，所有操作均在冰上進行。PCR反應體系為20 μL,包括2×qPCR Master Mix(SYBR) 10 μL、10 μmol/L引物0.4 μL、5 U/μL Taq DNA 多聚酶0.2 μL、模板cDNA 3 μL，雙蒸水補足至20 μL。采用ABI PRISM 7500 PCR儀進行擴增。mRNAs反應條件為：95 ℃ 15 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,40個循環。miRNAs反應條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s,62 ℃ 40 s,40個循環。miRNAs的表達水平用內參U6 snRNA標準化，DNA-PKcs和RAD21 mRNA的表達水平用內參β-actin標準化，用 2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 引物序列

1.3 細胞中DNA-PKcs、RAD21蛋白的檢測 用蛋白裂解液提取細胞中的蛋白[11]。用1×裂解液制備蛋白樣品，(50～160) g/L梯度分離膠電泳，轉膜12 h×250 mA。體積分數5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加一抗4 ℃振蕩過夜孵育。磷酸化DNA-PKcs(p-DNA-PKcs)和RAD21抗體購于Abcam公司，總DNA-PKcs(t-DNA-PKcs)購于Cell Signaling Technology公司，p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、RAD21抗體稀釋度均為1:3 000，內參β-actin抗體稀釋度為1:5 000。然后TBST洗膜3次，二抗孵育60 min，洗膜3次后ECL染色，用FluorChem FC3成像儀采集圖像，進行灰度分析，計算目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理 用SPSS 17.0進行數據分析，5組間各指標的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗指標之間的相關性采用Pearson相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 5組TE7細胞中miRNAs及mRNAs的表達情況 見表2。隨照射劑量的增大，TE7細胞中miR-126、DNA-PKcs mRNA和RAD21 mRNA的表達逐漸升高，miR-101的表達降低。

表2 5組TE7細胞中miRNAs及mRNAs的表達

*：與0 Gy組比較，P<0.05；#：與2 Gy組比較，P<0.05；△：與4 Gy組比較，P<0.05；▲：與6 Gy組比較，P<0.05。

2.2 5組TE7細胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表達情況 5組TE7細胞中p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、RAD21蛋白的表達差異無統計學意義，見圖1、表3。

圖1 5組TE7細胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表達

表3 5組TE7細胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表達

2.3 放射照射后TE7細胞中miR-126、miR-21和miR-101水平與DNA修復蛋白表達的相關性分析 采用Pearson相關分析發現，當吸收劑量為4 Gy時，miR-126、miR-101與RAD21蛋白的表達呈負相關，r分別為-0.899(P=0.008)、-0.853(P=0.019)。

3 討論

食管癌的放療抵抗是導致治療失敗的主要原因，因此提高癌細胞的放射敏感性可提高食管癌的治療效果。放療抵抗的主要機制之一是PI3K/Akt信號通路的過度激活，AKT可激活DNA-PKcs，從而促進DNA雙鏈斷裂的修復，降低腫瘤細胞的放射敏感性[2]。Toulany等[12]研究發現雙重作用于PI3K 和MEK可以增強A549 和H460 細胞的放療敏感性。DNA-PK中的Ku70、Ku80是組成Ku蛋白的調節亞基，在DNA雙鏈斷裂修復中起著辨認、結合排列DNA末端并募集催化亞基DNA-PKcs的作用。DNA-PKcs可磷酸化LigaseⅣ、XRCC4，從而使得后者發揮連接雙鏈斷裂DNA的作用。腫瘤細胞中任意一個組分缺陷均可導致DNA-PK活性喪失，而致放射敏感性增強[4]。RAD21最初在酵母粟酒中被發現，其可以保持姐妹染色單體的結合并確保復制染色體正確分離并進入子細胞，可以直接或間接地促進HRR[6]。de Andrade等[11]發現放射照射后膠質瘤細胞中DNA-PKcs的表達顯著升高。Yang等[13]發現肝癌細胞HepG2 中DNA-PKcs 蛋白表達升高，60Co γ電離輻射可進一步增強DNA-PKcs的表達，而DNA-PK抑制劑NU7441能夠增強 HepG2 細胞的放療敏感性。Bauerschmidt等[5]發現10 Gy X射線照射后，宮頸癌細胞中RAD21表達升高。該研究結果顯示， X射線照射后，食管鱗癌細胞TE7中DNA-PKcs和RAD21 mRNA表達水平升高，且兩者的表達隨照射劑量的增大而增加，但在蛋白水平上并沒有顯示出這種效應。

miRNA是一類非編碼的小RNA，可綁定多個靶向mRNAs的3′-UTR，通過阻斷靶基因翻譯或下調靶基因表達，參與細胞分化、增殖、凋亡、代謝、死亡等過程的調控[14]。因此識別并調控針對DNA雙鏈斷裂修復的miRNAs，有可能提高腫瘤細胞的放療敏感性。該研究對X射線照射后TE7細胞中miR-101、miR-21、miR-126的表達進行了檢測。

Nie等[15]的研究結果顯示，人食管鱗癌組織中miR-126低表達，miR-126可通過調節PI3K/AKT信號通路抑制EC109細胞的增殖和遷移。Templin和Vincenti等[16-17]發現放療后患者外周血中miR-126表達升高，提示其可以作為放療敏感性的一個標志物。Yan等[18]用熒光素酶報告法證明了miR-101可通過靶向調節DNA-PKcs和ATM來增強肺癌細胞株的放療敏感性。該研究結果顯示，X射線照射后食管鱗癌細胞TE7中miR-126表達升高，miR-101表達降低，且兩者的表達隨照射劑量的增大而變化；當吸收劑量為4 Gy時，TE7中miR-101、miR-126與RAD21蛋白表達均呈負相關，與p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs的表達無相關性，提示miR-126及miR-101可能通過調節HRR通路蛋白RAD21的表達影響TE7細胞的放療敏感性。

綜上所述，該研究發現X射線照射后TE7細胞存在放射性抵抗現象，DNA-PKcs mRNA及RAD21 mRNA表達升高。miR-126及miR-101可能通過調節HRR通路蛋白RAD21的表達來影響TE7細胞的放療敏感性，這為食管癌的臨床治療提供了新思路。

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(2016-11-18收稿 責任編輯王 曼)

Expressions of miRNAs and DNA damage repair factors in esophageal squamous cell carcinoma cell line TE7 after X-ray radiation

ZHAOXiaojing1),MAJun1),YUANLing2),WANGKunlun2),LINan3),ZHANGZhongmian3),SUNJia3)

1)DepartmentofDigestiveDiseases,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofRadiotherapy,theAffiliatedCancerHospital,ZhengzhouUniversity;HenanProvincialCancerHospital,Zhengzhou450014 3)DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

esophageal carcinoma;miR-126；miR-21；miR-101；DNA-PKcs；RAD21；radiation

Aim: To explore the expressions of miRNAs and DNA repair factors in esophageal squamous cell carcinoma cell line TE7 after radiation. Methods: Real-time PCR was used to detect the expressions of miR-126, miR-21, miR-101, DNA-PKcs, and RAD21 mRNA in TE7 cells treated with different doses(0, 2, 4, 6, 8 Gy) of X-ray radiation, and Western blot was used to detect the expressions of DNA-PKcs and RAD21 protein. Results: In TE7 cells treated with X-ray radiation, the expressions of miR-126, DNA-PKcs and RAD21 mRNA were up-regulated with the dose increasing(P<0.05), that of miR-101 was down-regulated (P<0.05), and the expressions of phospho-DNA-PKcs, total DNA-PKcs and RAD21 protein had no statistical changes(P>0.05). The expressions of miR-126 and miR-101 were negatively correlated with that of RAD21 protein(r=-0.899,-0.853，P<0.05) in TE7 cells treated with 4 Gy radiation.Conclusion: MiR-126 and miR-101 may influence the radio-sensitivity of TE7 cells by regulating the expression of RAD21.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.002

*河南省科技廳科技攻關項目 152300410164

R735.1