慢病毒介導(dǎo)的FOXQ1過表達(dá)對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的影響*

張 濤，王 攀，馬珊珊，石振慶，程 康，黃團(tuán)結(jié)，劉艷霞，楊 波，關(guān)方霞#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；河南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

慢病毒介導(dǎo)的FOXQ1過表達(dá)對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的影響*

張 濤1)，王 攀2)#，馬珊珊1)，石振慶1)，程 康1)，黃團(tuán)結(jié)1)，劉艷霞1)，楊 波3)，關(guān)方霞1)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；河南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

#通信作者，關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail：guanfangxia@126.com；王攀，男，1986年11月生，博士，助理研究員，研究方向：細(xì)胞衰老機(jī)制，E-mail：wpzzu2004@126.com

FOXQ1；過表達(dá)；慢病毒載體；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；衰老

目的：構(gòu)建FOXQ1慢病毒載體，探究FOXQ1過表達(dá)對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)衰老的影響。方法：PCR擴(kuò)增FOXQ1序列，構(gòu)建慢病毒pHBLV-FOXQ1-Puro重組載體，包裝病毒、感染hUC-MSCs(過表達(dá)組)，感染空載體病毒的hUC-MSCs為對照，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測2組細(xì)胞FOXQ1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力的變化，采用SA-β-Gal與AP染色檢測hUC-MSCs衰老表型。結(jié)果：慢病毒pHBLV-FOXQ1-Puro重組載體構(gòu)建成功，病毒包裝后感染hUC-MSCs效果良好。過表達(dá)組FOXQ1蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)。過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，F(xiàn)OXQ1過表達(dá)可以延緩hUC-MSCs衰老。結(jié)論：成功建立FOXQ1穩(wěn)定過表達(dá)的hUC-MSCs細(xì)胞系，F(xiàn)OXQ1過表達(dá)可以延緩hUC-MSCs衰老。

叉頭框(forkhead box,FOX)家族在胚胎發(fā)育、糖類和脂類代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[1]。FOXQ1是近年研究較多的FOX家族成員，目前發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織高表達(dá)，通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[2]，增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖侵襲能力[3]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)在體外培養(yǎng)過程中容易衰老，影響其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。作者旨在建立一種成熟有效的FOXQ1過表達(dá)手段，進(jìn)一步探究過表達(dá)該基因在hUC-MSCs衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 hUC-MSCs由臍帶(正常剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn))分離、純化后，培養(yǎng)至第3代使用。慢病毒包裝質(zhì)粒pHBLV-Puro、psPAX2、pMD2.G及FOXQ1模板質(zhì)粒pIRES-FOXQ1均由北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院童坦君教授惠贈(zèng)。293T細(xì)胞由鄭州大學(xué)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液購自Hyclone公司。KOD FX DNA聚合酶購自Toyobo公司，核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ酶購自TaKaRa公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN公司，磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購自Leagene公司，嘌呤霉素購自Gene Operation公司。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RNA提取試劑盒及PCR相關(guān)引物購自上海生工生物工程有限公司，F(xiàn)OXQ1一抗購自美國Santa Cruz公司，GAPDH一抗及山羊抗兔二抗購自武漢三鷹公司。CCK-8購自日本同仁公司。SA-β-Gal檢測試劑盒購自美國GENMED，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，AP)顯色試劑盒購自碧云天公司。

1.2 pHBLV-FOXQ1-Puro慢病毒骨架質(zhì)粒的構(gòu)建 以pIRES-FOXQ1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR。上游引物5’-CGGAATTCATGAAGTTGGAGGTGTTCG-3’，下游引物5’-GCTCTAGATCAGGCTAGGAGCGTCT-3’。反應(yīng)體系參照KOD FX DNA聚合酶使用說明書。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，34個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，電泳后成像觀察切膠回收，將PCR產(chǎn)物插入pHBLV-Puro質(zhì)粒EcoR Ⅰ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)之間，調(diào)節(jié)目的片段及質(zhì)粒片段的酶切產(chǎn)物質(zhì)量濃度至50 mg/L，按5:1比例16 ℃連接，轉(zhuǎn)化熱激后，涂板倒置于37 ℃烘箱15 h。挑取若干單克隆搖菌16 h，菌液經(jīng)PCR鑒定，陽性克隆提取質(zhì)粒后送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng) hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]。293T細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同hUC-MSCs。

1.4 慢病毒包裝及感染 包裝：將慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G、pHBLV-FOXQ1-Puro及pHBLV-Puro分別通過轉(zhuǎn)化擴(kuò)大，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。將293T細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，12 h后將pHBLV-FOXQ1-Puro(A組)或pHBLV-Puro(B組)、psPAX2、pMD2.G按照1:1:1比例，磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，8 h后換液，36 h后提取病毒液，1 500 r/min離心5 min后，取上清液通過0.45 μm濾頭過濾，4 ℃保存?zhèn)溆?1周內(nèi)使用)。24 h后可二次提取病毒液。

感染：感染前12 h將hUC-MSCs傳代，使感染前細(xì)胞匯合度達(dá)到約40%。將A、B 2組病毒液分別感染hUC-MSCs(過表達(dá)組和對照組)，并加入終質(zhì)量濃度為5 mg/L聚凝胺，感染8 h后，更換為正常培養(yǎng)基。第1次感染24 h后可進(jìn)行二次感染。感染3 d后，加入終質(zhì)量濃度1 mg/L嘌呤霉素篩選3～5 d。

1.5 Western blot檢測FOXQ1蛋白的表達(dá)水平 收集2組hUC-MSCs，計(jì)數(shù)后取1×106個(gè)，提取細(xì)胞全蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離。加入按1:1 000稀釋的FOXQ1與GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜，加入1:4 000稀釋的相應(yīng)二抗孵育2 h，使用ECL發(fā)光液曝光，圖片使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測FOXQ1 mRNA的表達(dá)水平 收集2組hUC-MSCs，計(jì)數(shù)后取5×105個(gè)，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后于-20 ℃保存。使用SYBR Green染料法，反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，45個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 分別取2組第10代hUC-MSCs，計(jì)數(shù)后接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于12、36、60、84 h加入CCK-8孵育2 h，在酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 SA-β-Gal染色 分別取2組第5代hUC-MSCs，計(jì)數(shù)后以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，8 h后，使用SA-β-Gal檢測試劑盒檢測細(xì)胞衰老，衰老細(xì)胞呈藍(lán)色。于倒置顯微鏡下觀察，取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞。

1.9 AP染色 取2組第10代hUC-MSCs，計(jì)數(shù)后以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，8 h后，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min，按照試劑盒說明書進(jìn)行AP染色，陽性細(xì)胞染色偏向深棕色。倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組hUC-MSCs FOXQ1蛋白和mRNA表達(dá)水平及SA-β-Gal與AP染色陽性細(xì)胞數(shù)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 pHBLV-FOXQ1-Puro載體構(gòu)建結(jié)果 PCR擴(kuò)增結(jié)果條帶單一，亮度高，引物特異性強(qiáng)(圖1)；重組質(zhì)粒測序結(jié)果與FOXQ1基因CDS序列(NM_033260.3)進(jìn)行BLAST比對，全長1 212 bp，完全一致，提示載體構(gòu)建成功。

1：Marker;2:FOXQ1。圖1 PCR基因擴(kuò)增全長凝膠電泳圖

2.2 hUC-MSCs分離培養(yǎng)及感染后形態(tài)學(xué)觀察 原代干細(xì)胞呈扁平長梭狀，體型較小，感染后第3代hUC-MSCs較原代細(xì)胞略長(圖2)。

A：原代hUC-MSCs；B：對照組；C：過表達(dá)組。圖2 hUC-MSCs形態(tài)學(xué)觀察(×100)

2.3 2組hUC-MSCs中FOXQ1蛋白和mRNA的表達(dá)水平比較 過表達(dá)組hUC-MSCs中FOXQ1蛋白和mRNA的表達(dá)水平均高于對照組(圖3、表2)。

圖3 2組Western blot結(jié)果比較

表2 2組FOXQ1蛋白及mRNA表達(dá)水平的比較

2.4 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果 過表達(dá)組細(xì)胞生長速度高于對照組(圖4)。

A：過表達(dá)組；B：對照組。圖4 2組增殖曲線

2.5 SA-β-Gal和AP染色結(jié)果 過表達(dá)組hUC-MSCs藍(lán)染細(xì)胞(衰老細(xì)胞)數(shù)明顯低于對照組，AP染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組，見圖5、6，表3。

A：過表達(dá)組；B：對照組。圖5 2組hUC-MSCs SA-β-Gal染色觀察(×100)

A：過表達(dá)組；B：對照組。圖6 2組hUC-MSCs AP染色觀察(×100)

表3 2組SA-β-Gal與AP染色結(jié)果比較陽性細(xì)胞數(shù)

3 討論

FOXQ1蛋白作為FOX家族重要的一員，具有重要的生物學(xué)作用。FOXQ1在結(jié)腸癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]、肝癌[8]等多種癌組織異常高表達(dá)，F(xiàn)OXQ1的表達(dá)量直接與癌變階段、惡性程度正相關(guān)[9]。而且，高表達(dá)FOXQ1的患者多預(yù)后不佳[10]。FOXQ1在細(xì)胞增殖、侵襲及細(xì)胞周期分布等方面具有重要調(diào)控作用。在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231及胃癌細(xì)胞株 MGC-803 中沉默F(xiàn)OXQ1可以顯著降低癌細(xì)胞增殖能力[11-12]。腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[13-14]，而FOXQ1可直接被一些microRNA調(diào)控[15]，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

相對于真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染外源基因表達(dá)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，慢病毒系統(tǒng)具有對外源基因容量大、導(dǎo)入穩(wěn)定性強(qiáng)、感染細(xì)胞種類豐富等優(yōu)勢，近年來獲得了廣泛使用。同時(shí)，隨著技術(shù)進(jìn)步，慢病毒包裝系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展到第4代，具有更強(qiáng)的選擇性、穩(wěn)定性和安全性[16]。因此，通過慢病毒包裝系統(tǒng)過表達(dá)FOXQ1是一種安全穩(wěn)定且成熟有效的手段。

該研究首先構(gòu)建了FOXQ1過表達(dá)慢病毒，感染hUC-MSCs，并初步探究了FOXQ1過表達(dá)對hUC-MSCs衰老的影響。有研究[17]表明，隨著hUC-MSCs傳代次數(shù)的增加，其體外增殖能力、分化能力均呈下降趨勢。該研究結(jié)果顯示，過表達(dá)組hUC-MSCs增殖能力明顯強(qiáng)于對照組；衰老相關(guān)SA-β-Gal染色顯示，過表達(dá)組細(xì)胞衰老程度弱于對照組，AP染色實(shí)驗(yàn)顯示了相同的結(jié)果。上述結(jié)果表明FOXQ1過表達(dá)可有效延緩hUC-MSCs衰老，增強(qiáng)干細(xì)胞作用。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)建立了FOXQ1慢病毒穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，在hUC-MSCs中成功過表達(dá)FOXQ1，并初步探討了FOXQ1對hUC-MSCs的抗衰老作用，為后續(xù)研究FOXQ1過表達(dá)延緩hUC-MSCs衰老的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(2016-09-08收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of lentivirus-mediated FOXQ1 overexpression on senescence of hUC-MSCs

ZHANGTao1),WANGPan2),MAShanshan1),SHIZhenqing1),CHENGKang1),HUANGTuanjie1),LIUYanxia1),YANGBo3),GUANFangxia1)

1)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity;KeyClinicalLaboratoryofHenanProvince,Zhengzhou450052 3)DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

FOXQ1；overexpression；lentivirus vector；hUC-MSC；senescence

Aim: To construct the FOXQ1 overexpression lentivirus vector and explore the effect of FOXQ1 overexpression on human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) senescence. Methods: After amplification of FOXQ1 sequences, the recombinant lentivirus vector(pHBLV-FOXQ1-Puro) was constructed. The hUC-MSCs overexpressing FOXQ1 infected by the prepared vector and screened by puromycin screening. The hUC-MSCs infected by the empty vector were used as control. The protein and mRNA expression levels of FOXQ1 were measured by Western blot and qPCR. CCK-8 assay was used to test the ability of cell proliferation. SA-β-Gal and AP staining assay were used to detect the effect of FOXQ1 overexpression on cell senescence.Results: pHBLV-FOXQ1-Puro recombinant vector was constructed successfully, and its infection was effective. The protein and mRNA expression levels of FOXQ1 overexpression group were significantly higher than control group (P<0.05). CCK-8 results showed that FOXQ1 overexpression could enhance the ability of cell proliferation. SA-β-Gal and AP staining results showed that FOXQ1 overexpression could delay senescence of hUC-MSCs. Conclusion: The hUC-MSCs overexpressing FOXQ1 have been successfully constructed, and FOXQ1 overexpression could delay the senescence of hUC-MSCs.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.005

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81471306，81501200；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目 15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目 154200510008；中國博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目 2015M572122；國家教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目 20114101110004

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