上調(diào)FOXC1的表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲的影響*

任琛琛，劉泇希，楊 立，薛景戈，李飛燕，劉 靈，李 靜，白 楊

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

上調(diào)FOXC1的表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲的影響*

任琛琛△，劉泇希，楊 立，薛景戈，李飛燕，劉 靈，李 靜，白 楊

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

△女，1968年11月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：renchenchen1106@126.com

SKOV3細(xì)胞；FOXC1；增殖；侵襲

目的：探討上調(diào)FOXC1的表達(dá)對卵巢漿液性腺癌SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲的影響。方法：分別以重組FOXC1慢病毒、慢病毒空載體穩(wěn)定感染SKOV3細(xì)胞(實驗組和載體對照組)，并以未感染慢病毒的SKOV3細(xì)胞為空白對照組，分別應(yīng)用qRT-PCR和Western blot法檢測3組細(xì)胞中FOXC1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用CCK-8法檢測3組細(xì)胞接種24、48、72 h后的增殖能力，用Transwell小室檢測接種24 h細(xì)胞的體外侵襲能力。結(jié)果：實驗組SKOV3細(xì)胞FOXC1 mRNA及蛋白的表達(dá)均較載體對照組及空白對照組升高(P<0.05)。與空白對照組及載體對照組相比，實驗組SKOV3細(xì)胞感染不同時間的增殖活性均降低，侵襲能力亦降低(P<0.05)。結(jié)論：上調(diào)FOXC1的表達(dá)能夠抑制SKOV3細(xì)胞的增殖及侵襲能力。

卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，其中卵巢漿液性腺癌是EOC中最常見的病理類型[1]。由于發(fā)病隱匿，多數(shù)EOC患者就診時已是晚期，目前在發(fā)達(dá)國家EOC的病死率居婦科腫瘤之首[2]。因此，了解EOC的發(fā)病機制對早期診斷及有效治療至關(guān)重要。FOXC1是叉頭框(forkhead box,FOX)家族的一員，通過自身的叉頭區(qū)DNA結(jié)合域結(jié)合目的基因片段啟動轉(zhuǎn)錄。目前已知FOXC1在胚胎發(fā)育和眼睛發(fā)育的調(diào)節(jié)中具有重要作用，其基因突變可導(dǎo)致人類Axenfeld-Rieger畸形等疾病[3]。近年來發(fā)現(xiàn)FOXC1除了參與細(xì)胞或器官分化及代謝等生物學(xué)過程外，還可能與多種腫瘤(乳腺癌、肝癌、胃癌等)的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)[4-6]。研究[7-8]表明：FOXC1在不同病理分型的EOC組織中的陽性表達(dá)率存在差異，提示FOXC1可能參與了EOC的發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移過程，但具體的生物學(xué)功能尚不明確。為進(jìn)一步了解FOXC1在EOC惡性生物學(xué)行為中的作用，該研究應(yīng)用慢病毒感染卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞SKOV3，外源性上調(diào)FOXC1后，觀察SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲力的變化，為進(jìn)一步探討FOXC1在EOC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 SKOV3細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室趙亞教授惠贈。FOXC1多克隆抗體(ab5079)購自英國Abcam公司，RPMI 1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。FOXC1慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒(p-EGFP-慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒)、qPCR引物及All-in-OneTMqPCR Mix檢測試劑盒均購自美國GeneCopoeiaTM公司。Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)凝膠購自Sigma公司。CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2 慢病毒感染及穩(wěn)定株的篩選 以7×104個/孔的密度將SKOV3細(xì)胞接種于24孔板。每孔分別加入滴度為5×108Tu/mL FOXC1慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒顆粒(實驗組)10 μL后再加入聚凝胺，至終濃度為5 mg/L，搖動混勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同樣設(shè)置載體對照組(感染慢病毒空載體)、空白對照組(未感染慢病毒的SKOV3細(xì)胞)。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。72 h后使用終質(zhì)量濃度為2 mg/L嘌呤霉素篩選培養(yǎng)1周。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，直至抗藥克隆出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)至克隆融合，隨后用胰蛋白酶消化，傳代至新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)及擴培，用于后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測3組細(xì)胞FOXC1 mRNA的表達(dá)水平 Trizol法提取3組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照All-in-OneTMqPCR Mix檢測試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR檢測。FOXC1引物序列：上游5’-CTTCTTCCTTGCCTCTCA-3’，下游5’-TCCACGA CATCCAACTAC-3’。 GAPDH引物序列:上游5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’,下游5’-GGTG GAATCATATTGGAACA-3’。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,35個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，檢測結(jié)果取平均值后根據(jù)公式2-ΔΔCT計算FOXC1 mRNA的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.4 Western blot法檢測3組細(xì)胞FOXC1蛋白的表達(dá)水平 將3組細(xì)胞分別接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)到90%后在冰上采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。以50 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。加入50 g/L脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉2 h,TBST洗滌3次。分別加一抗(FOXC1多克隆抗體按1:1 000稀釋，β-actin單抗按1:5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日應(yīng)用TBST洗膜3次，加FITC標(biāo)記的二抗(按1:2 000稀釋)室溫避光孵育2 h。TBST洗膜3次，應(yīng)用CLX Odyssey掃描儀掃描PVDF膜，系統(tǒng)軟件自動生成灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算FOXC1蛋白的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.5 CCK-8法檢測接種不同時間后3組細(xì)胞的增殖情況 取處于對數(shù)生長期的3組SKOV3細(xì)胞，以3×103個/孔接種于96孔板，每組均設(shè)置5個平行孔。在接種后的0、24、48、72 h，用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞在450 nm處的吸光度值，表示細(xì)胞增殖活性。

1.6 體外侵襲實驗檢測接種24 h 3組細(xì)胞的侵襲能力 將50 μL Matrigel膠鋪在Transwell小室的上室，37 ℃放置8 h。每組均在小室的上室中接種1×105個細(xì)胞，下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用棉簽擦凈上室內(nèi)細(xì)胞，PBS沖洗，40 g/L多聚甲醛固定20 min后，吉姆薩染液染色5 min。PBS洗滌30 min，通風(fēng)晾干后，選擇5個視野計數(shù)染色細(xì)胞，即為穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組SKOV3細(xì)胞中 FOXC1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性及穿膜細(xì)胞數(shù)，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FOXC1過表達(dá)的SKOV3細(xì)胞穩(wěn)定株的篩選

慢病毒感染的SKOV3細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況見圖1。3組細(xì)胞中FOXC1蛋白(圖2)及mRNA的表達(dá)水平比較見表1。與載體對照組和空白對照組相比，實驗組細(xì)胞中FOXC1在mRNA和蛋白水平均呈高表達(dá)。

A：實驗組；B：載體對照組。圖1 慢病毒感染后SKOV3細(xì)胞熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果(×40)

1：空白對照組；2：載體對照組；3：實驗組。圖2 3組SKOV3細(xì)胞FOXC1蛋白的表達(dá)情況

表1 3組SKOV3細(xì)胞中FOXC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

*：與其余2組相比，P<0.05。

2.2 3組SKOV3細(xì)胞增殖活性的比較 3組SKOV3細(xì)胞接種24、48、72 h后增殖活性的比較見表2。由表2可見，接種24、48、72 h后實驗組的增殖活性低于載體對照組及空白對照組。

表2 3組SKOV3細(xì)胞不同培養(yǎng)時間增殖活性的比較

*：與載體對照組和空白對照組相比，P<0.05。

2.3 3組SKOV3細(xì)胞體外侵襲能力的比較 接種24 h后，實驗組、載體對照組、空白對照組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(100.1±3.2)，(167.1±1.0)和(168.9±1.9)，3組間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=315.858，P<0.001)；與載體對照組及空白對照組相比，實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.001)。

3 討論

EOC是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其中卵巢漿液性腺癌占EOC的75%，因缺乏特異性早期診斷指標(biāo)以及有效的個體化治療，EOC患者的5 a生存率僅有30%左右[9]。

轉(zhuǎn)錄因子FOXC1位于人染色體6p25上，近年來認(rèn)為FOXC1與腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)，該基因突變導(dǎo)致的FOXC1表達(dá)缺失或異常活化均能引發(fā)許多疾病。目前有研究[7]提示：卵巢漿液性囊腺癌SKOV3和HO-8910細(xì)胞系中FOXC1在mRNA及蛋白水平均有表達(dá)，但FOXC1在EOC的發(fā)生發(fā)展中究竟扮演了怎樣的角色尚不明確。該研究選取SKOV3為實驗對象，利用慢病毒作為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體感染SKOV3細(xì)胞，大大提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，使其能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因。結(jié)果顯示，實驗組FOXC1的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平均較載體對照組及空白對照組升高，說明通過慢病毒感染SKOV3細(xì)胞能夠有效上調(diào)FOXC1在該細(xì)胞中的表達(dá)，并且經(jīng)過篩選，成為穩(wěn)定表達(dá)FOXC1的細(xì)胞株，為后續(xù)實驗提供了可靠的實驗基礎(chǔ)。

目前，F(xiàn)OXC1在腫瘤中的作用已成為研究熱點，并已發(fā)現(xiàn)FOXC1在不同組織、器官的腫瘤發(fā)生發(fā)展中分別扮演了抑癌或致癌的角色。Wang等[10]研究顯示在人基底樣乳腺癌中FOXC1可以通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)體外癌細(xì)胞系的增殖、侵襲及遷移；并且FOXC1可以與VEGF通過Notch信號相互作用，從而調(diào)節(jié)血管基因的表達(dá)并誘導(dǎo)腫瘤血管生成。而Zhou等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過上調(diào)FOXC1的表達(dá)從而負(fù)性調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖，間接提示FOXC1可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。該研究結(jié)果顯示，通過慢病毒感染方式上調(diào)SKOV3細(xì)胞株中FOXC1的表達(dá)后，體外培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞增殖活性及侵襲能力受到了明顯的抑制，但是具體機制仍不清楚。有研究[10-12]提示FOXC1在腫瘤中可能是通過NF-κB、VEGF/Notch、TGF-β/Smad、Wnt等多條細(xì)胞信號通路發(fā)揮作用。FOXC1發(fā)揮作用的同時可能伴隨著多種調(diào)控方式及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與，不同狀態(tài)下何種通路占優(yōu)勢可能會影響FOXC1在疾病中的作用。

綜上所述，F(xiàn)OXC1的表達(dá)增高可抑制SKOV3細(xì)胞的增殖及侵襲。但該研究僅從體外實驗分析了FOXC1過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞系的某些生物學(xué)功能的影響，尚缺乏EOC更多細(xì)胞系的驗證及相關(guān)的動物實驗證實。隨著對FOXC1在EOC體內(nèi)實驗及具體作用機制的深入探究，其有望成為EOC治療中的有效靶點之一。

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(2016-11-18收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Impact of up-regulating FOXC1 expression on proliferation and invasion of SKOV3 cells

RENChenchen,LIUJiaxi,YANGLi,XUEJingge,LIFeiyan,LIULing,LIJing,BAIYang

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

SKOV3 cell;FOXC1;proliferation;invasion

Aim: To explore the changes of proliferation and invasion in SKOV3 cells after up-regulating the expression of FOXC1. Methods: SKOV3 cells were divided into 3 groups: cells in experimental group were infected with p-EGFP-lentiviral vector with overexpressed FOXC1 plasmids, cells in vector control group were infected with empty p-EGFP-lentiviral vector, and cells in blank control group, not infected. The expressions of FOXC1 mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot,respectively. The cell proliferation after 24,48 and 72 h infection and cell invasion after 24 h infection were observed by CCK-8 kit and Transwell invasion assay,respectively. Results: The expressions of FOXC1 mRNA and protein in SKOV3 cells in experimental group were significantly higher than those in the vector control and blank control groups(P<0.05).Compared with blank control group and vector control group, the proliferation activity of SKOV3 cells in experimental group was reduced at different time points, so was the invasive ability(P<0.05).Conclusion: Up-regulation of FOXC1 may suppress cell proliferation and invasion of SKOV3 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.008

*河南省科技廳科技攻關(guān)項目 162102310131

R737.31