蘿卜硫素對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響*

羅真真，張 震，喬亞敏，陳新峰，黃 嵐，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

蘿卜硫素對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響*

羅真真1,2,3)，張 震1,2,3)，喬亞敏1,2,3)，陳新峰1,2,3)，黃 嵐1,2,3)，張 毅1,2,3,4)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤免疫學(xué)、腫瘤干細(xì)胞和生物細(xì)胞治療，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

蘿卜硫素;結(jié)直腸癌;SW620細(xì)胞；STAT3;NF-κB;MMP

目的：觀察蘿卜硫素(SFN)對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法：采用CCK-8法檢測(cè)0、5、10、15、20 μmol/L SFN處理48、72 h對(duì)SW620細(xì)胞增殖能力的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0、5、10、15、20 μmol/L SFN處理24、48 h對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察20 μmol/L SFN處理24 h對(duì)SW620細(xì)胞遷移的影響，并采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中STAT3、NF-κB、p-STAT3、p-NF-κB及MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果：隨著SFN濃度的升高，SW620細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。同時(shí)20 μmol/L SFN可明顯減弱SW620細(xì)胞的遷移能力，降低p-STAT3、p-NF-κB與MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：SFN抑制SW620細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的機(jī)制可能與降低p-STAT3、p-NF-κB的表達(dá)有關(guān)，抑制侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與其降低MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)有關(guān)。

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的胃腸道腫瘤，其5 a生存率較低，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已處于晚期，且復(fù)發(fā)率較高[1]。目前常用的化療藥物如5-FU和絲裂霉素等臨床療效尚不能令人滿意，且伴有很強(qiáng)的毒副作用，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。因此，開(kāi)發(fā)療效確切且毒副作用較小的新藥迫在眉睫。植物類抗腫瘤藥物如姜黃素、蘿卜硫素(sulfraphane，SFN)等，以其抗腫瘤效果明確、毒副反應(yīng)少、可增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力以及減少術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等優(yōu)點(diǎn)逐漸引起人們的關(guān)注[3-4]。SFN亦稱萊菔硫烷，提取自西蘭花、芥藍(lán)、北方圓紅蘿卜等十字花科植物。有研究[5]表明，SFN具有很強(qiáng)的抗癌防癌作用，它在體外能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞阻滯，誘導(dǎo)人體內(nèi)的Ⅱ相代謝酶，同時(shí)抑制Ⅰ相代謝酶的產(chǎn)生，最終通過(guò)多種酶體系排出致癌物和自由基等有害成分。然而,SFN抗癌作用機(jī)制目前尚未完全了解。作者通過(guò)體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞株，觀察SFN對(duì)SW620細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SW620細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司；SFN、胰蛋白酶、膜連蛋白-異硫氫酸熒光素(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2、MMP-9、β-actin抗體購(gòu)于CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SW620細(xì)胞采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 d傳代1次，選取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，以5×104mL-1的密度接種至96孔板，每孔100 μL。貼壁后分別加0、5、10、15、20 μmol/L 的SFN，每個(gè)藥物濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)48及72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，避光孵育2 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定光密度值，取均值，表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，以4.0×105mL-1密度接種于12孔板,每孔1 mL。貼壁后分別加入濃度為0、5、10、15、20 μmol/L的SFN，分別培養(yǎng)24及48 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 500 r/min離心，棄上清。 PBS重懸細(xì)胞，離心洗滌2次，加入200 μL Binding Buffer和1 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min。上機(jī)前再加入PI染液2 μL，立即上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，加入2 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，用10 μL槍頭在中間劃一橫線，分2組，分別加入20 μmol/L SFN和同等體積DMSO(對(duì)照組)，0、24 h后分別觀察照相，使用圖像處理軟件測(cè)量劃痕寬度。劃痕愈合度=(0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6 Western blot法檢測(cè)凋亡及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4.0×105mL-1，接種于6孔板，總體積2 mL。待細(xì)胞貼壁后，分2組，分別加入20 μmol/L SFN和同等體積DMSO(對(duì)照組)。培養(yǎng)24 h后，收集懸浮及貼壁的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液。使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入4×Loading Buffer蛋白上樣緩沖液，煮沸 10 min后上樣，每孔上樣量保證為30 μg。使用含體積分?jǐn)?shù)5% BSA的TBS將一抗(STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2、MMP-9、β-actin)稀釋至合適濃度，4 ℃過(guò)夜，二抗封閉孵育1 h，TBST 清洗3次，每次 5 min,ECL發(fā)光液孵育后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析以及LSD-t檢驗(yàn)比較不同濃度的SFN處理不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力、凋亡率的差異，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和20 μmol/L SFN處理組劃痕愈合度以及STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SFN對(duì)SW620細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，作用48和72 h，隨SFN濃度的增加，SW620細(xì)胞增殖能力均呈降低的趨勢(shì)。

表1 SFN對(duì)SW620細(xì)胞增殖能力的影響

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05;#：與5 μmol/L組相比，P<0.05;△:與10 μmol/L組相比，P<0.05。

2.2 不同濃度SFN對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，作用24 h和48 h，隨SFN濃度的增加，SW620細(xì)胞凋亡率呈升高的趨勢(shì)。

表2 SFN對(duì)SW620細(xì)胞凋亡率的影響 %

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05；#：與5 μmol/L組相比，P<0.05；△：與10 μmol/L組相比，P<0.05;☆:與15 μmol/L組相比，P<0.05。

2.3 SFN對(duì)SW620細(xì)胞遷移能力的影響 20 μmol/L SFN處理組劃痕愈合度為(32.681±4.620)%，較對(duì)照組[(67.271±5.531)%]明顯降低(t=10.734,P<0.001)。

2.4 SFN對(duì)SW620細(xì)胞凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 20 μmol/L SFN處理細(xì)胞24 h后，SW620細(xì)胞STAT3、NF-κB的表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-STAT3、p-NF-κB、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組下降。結(jié)果見(jiàn)圖1及表3。

1：對(duì)照組；2：20 μmol/L SFN處理組。圖1 SFN對(duì)SW620細(xì)胞凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

表3 2組細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)

3 討論

Hanahan等[6]總結(jié)和提出了腫瘤十大特征，包括細(xì)胞無(wú)限增殖，抑制細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)血管生成以及激活侵襲和轉(zhuǎn)移，炎癥促進(jìn)腫瘤等。與其他人源性腫瘤的研究結(jié)果[7-8]相似，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SFN可有效促進(jìn)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞凋亡，抑制其增殖及遷移能力。

此外，該研究結(jié)果還顯示SFN可顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中STAT3和NF-κB的磷酸化水平，抑制STAT3及NF-κB信號(hào)通路。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，STAT3具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活雙重作用，通過(guò)介導(dǎo)炎癥因子的過(guò)表達(dá)并抑制腫瘤特異性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展。而NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)，并調(diào)控多種功能基因的表達(dá)。此外，異常活化的NF-κB既可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，還可通過(guò)上調(diào)促細(xì)胞存活基因和抗凋亡基因表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，同時(shí)也與腫瘤細(xì)胞遷移、擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]。SFN可能通過(guò)降低STAT3、NF-κB的磷酸化水平，從而促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。

臨床觀察表明，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，因此，癌細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是抗腫瘤機(jī)制研究的重點(diǎn)，也是許多研究關(guān)注的熱點(diǎn)。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的過(guò)程，原發(fā)部位腫瘤需穿透基底膜才能侵入血管或淋巴管。MMPs可特異性降解基底膜中的有效成分及細(xì)胞外基質(zhì)，從而破壞基底膜，為癌細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移排除了首要障礙；還可通過(guò)促進(jìn)毛細(xì)血管新生等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及擴(kuò)散[13]。MMP-2及MMP-9作為MMP家族成員，有報(bào)道[14]顯示其表達(dá)異常與結(jié)直腸惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。該實(shí)驗(yàn)中，20 μmol/L SFN處理后，SW620細(xì)胞的遷移能力減弱，同時(shí)MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)水平降低，推測(cè)SFN抑制SW620細(xì)胞侵襲遷移能力的機(jī)制可能與降低MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，SFN在體外可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖、促進(jìn)其凋亡，同時(shí)可減弱SW620細(xì)胞的遷移能力，推測(cè)SFN降低p-STAT3、p-NF-κB與MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一，為SFN在結(jié)直腸癌治療的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(2016-08-08收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of sulforaphane on proliferation,apoptosis and migration of SW620 cells

LUOZhenzhen1,2,3),ZHANGZhen1,2,3),QIAOYamin1,2,3),CHENXinfeng1,2,3),HUANGLan1,2,3),ZHANGYi1,2,3,4)

1)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Bio-therapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)EngineeringandTechnologyResearchCenterforTumorImmunotherapyofHenanProvince,Zhengzhou450052 4)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

sulforaphane;colorectal cancer;SW620 cell;STAT3;NF-κB;MMP

Aim: To observe the effects of sulforaphane(SFN) on proliferation, apoptosis, and migration of SW620 cellsinvitroand to explore the potential mechanism involved.Methods: SW620 cells were treated with 0，5，10，15，20 μmol/L SFN for 48，72 h and the cell proliferation was detected by CCK-8 kit. SW620 cells were treated with 0，5，10，15，20 μmol/L SFN for 24，48 h and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. SW620 cells were treated with 20 μmol/L SFN for 24 h, the migration capability was measured by the wound healing test, and the protein expression levels of STAT3, p-STAT3, NF-κB, p-NF-κB, MMP-2 and MMP-9 were determined by Western blot. Results: SFN significantly reduced the proliferation and increased apoptosis in a dose-dependent manner(P<0.05). The ability of migration was significantly inhibited by 20 μmol/L SFN(P<0.05),and the expressions of p-STAT3, p-NF-κB, MMP-2, and MMP-9 protein were significantly down-regulated(P<0.05). Conclusion: It is indicated that SFN could inhibit the proliferation and the ability of migration, and induce apoptosis of SW620 cells, which may be related with its down-regulating the expressions of p-STAT3, p-NF-κB, MMP-2 and MMP-9 protein.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.010

*河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究基金 112300410153，122300410155

R735.3