腫瘤床出血的非典型垂體腺瘤組織中Ki-67與CD34的表達*

張 嵐，郭付有

1)河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院磁共振科 鄭州 450000 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經外科 鄭州 450052

腫瘤床出血的非典型垂體腺瘤組織中Ki-67與CD34的表達*

張 嵐1)，郭付有2)#

1)河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院磁共振科 鄭州 450000 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經外科 鄭州 450052

#通信作者，男，1973年10月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：中樞神經系統(tǒng)腫瘤外科治療學，E-mail:guofuyou888@aliyun.com

非典型垂體腺瘤；腫瘤床出血；Ki-67；CD34

目的：探討CD34在發(fā)生腫瘤床出血(TBB)的非典型垂體腺瘤(APA)組織中的表達及與TBB的關系。方法：收集194例手術治療的垂體腺瘤患者資料，采用免疫組化法檢測Ki-67和CD34的表達情況，研究17例APA的臨床資料、MRI表現和免疫組化特點，分析APA術中發(fā)生TBB與CD34表達水平之間的關系。結果：17例APA均為巨大腺瘤；14例APA術中發(fā)生少到中等量的出血，腫瘤全部切除；2例出現嚴重的TBB，行腫瘤次全切術。MRI表現多為T1WI等信號或T2WI等-高信號，增強掃描明顯強化。17例APA的Ki-67 LI范圍為3.2%～12.0%；CD34在發(fā)生TBB的16例APA與無TBB垂體腺瘤組織中的表達量分別為(26.8±7.7)和(10.6±5.3)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.025)。 結論：CD34陽性表達和腫瘤富血供的MRI表現特點相結合有助于了解APA發(fā)生TBB的機制，判斷和預測APA的預后。

2004年WHO對垂體腫瘤分類進行了修改，將垂體腺瘤分為典型垂體腺瘤(typical pituitary adenoma, TPA)和非典型垂體腺瘤(atypical pituitary adenoma, APA)[1]。APA為介于TPA和垂體腺癌的交界性腫瘤，血供豐富，易發(fā)生術中腫瘤床出血(tumor bed blooding, TBB)[2]。TBB的發(fā)生往往預示著手術風險高，手術難度大，手術很難全切腫瘤。該研究通過分析發(fā)生TBB的APA的免疫組化特點和影像學特征，探討CD34在APA中的表達及與TBB之間的關系，為臨床提供判斷APA術中發(fā)生TBB的可靠依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2012年1月至2014年6月在河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院神經外科經手術切除且病理證實為垂體腺瘤的194例患者。該組研究對象均滿足以下條件：①符合2004年WHO對APA的定義[3]，Ki-67標記指數(Ki-67 labeling index，Ki-67 LI)>3%，P53免疫反應性過度表達及核分裂活性增加。②手術由經驗豐富的高年資神經外科醫(yī)師完成。③患者術前均進行磁共振成像(MRI)檢查、內分泌及眼科檢查。④術中無靜脈竇及頸內動脈損傷。滿足上述條件的共17例APA，女10例，男7例，年齡28～66(49.3±6.8)歲。16例為初次手術；1例因在當地醫(yī)院術中大量出血而未能切除，3個月后來河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院就診行第2次手術。另有1例1 a前曾行γ-刀治療但療效不佳。

1.2 MRI檢查 所有患者術前均行MRI平掃及增強掃描。采用Siemens Trio 3.0T磁共振掃描機，平掃行冠狀位、矢狀位掃描。掃描參數如下，T1WI：TR 420 ms，TE 10 ms，層厚2 mm，層間距0.2 mm，矩陣256×256，視野(FOV)20 cm×20 cm；T2WI：TR 4 000 ms，TE 105 ms，層厚2 mm，層間距0.2 mm，矩陣512×512，FOV 20 cm×20 cm。平掃后行增強掃描，經肘部靜脈注射Gd-DTPA，劑量為0.1 mmol/kg，掃描參數同平掃。

1.3 手術方法 由神經外科醫(yī)師依據其臨床經驗和腫瘤的位置選取不同的手術入路方式，包括經蝶竇和經顱2種方式。13例經右側單鼻孔-蝶竇入路，4例經顱入路。經右側單鼻孔-蝶竇入路者切口選擇在外耳相對應的鼻中隔根部，從鼻中隔分離黏膜，放置牽引器并用咬骨鉗移除骨黏膜，然后切除蝶鞍部的骨質和硬腦膜。16例患者術中出現TBB，14例為小到中等量TBB，腫瘤組織全部切除；2例為嚴重TBB，在快速輸血及明膠海綿和醫(yī)用膠按壓止血后腫瘤組織部分切除。

1.4 腫瘤組織中Ki-67與CD34的免疫組化檢測

所有垂體腺瘤組織標本均以體積分數10%中性甲醛固定并以石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，經HE和P53染色，病理確診為垂體腺瘤，采用SP法進行Ki-67和CD34免疫組化檢測，DAB顯色，蘇木素復染。Ki-67計數采用Pizarro改良法[4]，選取5個200倍視野分別計數Ki-67 陽性細胞數及總細胞數。計數時除去壞死組織、成纖維細胞、內皮細胞和血細胞等。Ki-67 LI=陽性細胞數/總細胞數×100%。CD34表達以內皮細胞的細胞核膜呈棕黃色為陽性。CD34計數采用Ortiz-plata等[5]方法，先在100倍視野下全面觀察切片，找到腫瘤內新生血管密集區(qū)，然后在200倍視野下選取5個不重復的視野，計數陽性血管數并求其平均值。

1.5 MRI圖像分析 在MRI圖像上進行測量，腫瘤最大徑≤10 mm為垂體微腺瘤，>10 mm為垂體大腺瘤，>40 mm為垂體巨大腺瘤。根據Knosp分級[6]判斷腫瘤的侵襲范圍：腫瘤擴張超過相應頸內動脈海綿竇段外側切線為侵犯海綿竇；腫瘤突破鞍隔或高于視交叉下緣為腫瘤侵犯鞍上；腫瘤突入至蝶竇或累及斜坡為腫瘤侵犯鞍下。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，無TBB垂體腺瘤患者與APA伴TBB患者腫瘤組織中CD34表達量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 APA臨床表現 見表1。該組垂體腺瘤患者中APA的發(fā)生率為8.8%(17/194)，均為大腺瘤，3例為巨大腺瘤。術前內分泌測定11例為激素分泌活躍腫瘤，6例為非功能性腺瘤。5例泌乳素(PRL)水平升高，3例生長激素(GH)水平升高，2例促腎上腺皮質激素(ACTH)水平升高，1例同時合并PRL和GH水平升高。14例術中發(fā)生小到中等量TBB，出血量為140～450 mL；2例為嚴重TBB，分別失血1 200和1 000 mL。與術前癥狀相比，術后11例患者視力得到改善，術后2周內分泌檢查GH、PRL和ACTH水平均明顯下降。15例患者術后出現短暫的尿崩癥。

表1 17例APA患者的臨床和病理資料

2.2 APA的MRI表現 腫瘤可局限鞍內，也可達鞍上、鞍下，也可累及單側或雙側海綿竇。MRI表現如下：T1WI上14例為等信號，2例等-低信號，1例為等-高信號；T2WI上7例為等-高信號，4例為等信號，3例為高信號、2例為等-低信號，1例為低-高信號。增強掃描后，5例均勻強化(圖1)，11例不均勻強化(圖2)，1例輕度強化。2例伴有嚴重TBB的APA，T1WI和T2WI均呈等信號，腫瘤內見大量不成熟的流空血管影，增強后顯著強化(圖3)。

A、B：術前MRI增強，鞍區(qū)腫瘤明顯強化，累及鞍上和雙側海綿竇；C、D：術后MRI增強，腫瘤全部切除，術后復查未見腫瘤殘留。圖1 鞍區(qū)APA 1例的術前與術后MRI表現

A、B：術前MRI增強，腫瘤呈不均勻明顯強化，向鞍上生長累及視交叉；C、D：術后MRI增強，因APA術中發(fā)生嚴重TBB，蝶竇入路后只能行小部分腫瘤切除，術后殘留大部分腫瘤。圖2 鞍區(qū)APA伴嚴重TBB 1例的術前與術后MRI表現

A～D：第2次術前MRI平掃T1WI和增強，腫瘤呈等信號伴不成熟流空血管影，增強后呈較均勻強化；E、F：第2次術后MRI增強，經顱入路后腫瘤全部切除。圖3 鞍區(qū)APA伴嚴重TBB 1例第2次術前與術后MRI表現

2.3 腫瘤組織中Ki-67與CD34的免疫組化檢測結果 見圖4、5。17例APA的Ki-67 LI為3.2%～12.0%，平均(7.4±4.6)%；16例發(fā)生TBB的APA，CD34表達量為8.0～64.0。APA伴TBB患者腫瘤組織中CD34表達量較無TBB垂體腺瘤患者高，差異有統(tǒng)計學意義(表2)。2例發(fā)生嚴重TBB的APA患者，其CD34表達量分別為56.0和64.0(圖5)。

A：鏡下腫瘤細胞核大小一致，染色質纖細，核仁不明顯，可見核分裂(HE,×400)；B：Ki-67染色(SP,×200)；C：腫瘤細胞核P53染色呈強陽性(SP,×200)；D：CD34染色(SP,×200)。圖4 鞍區(qū)APA 1例的HE和免疫組化染色結果

A：Ki-67染色(SP,×400)；B：CD34染色(SP,×200)。圖5 APA伴嚴重TBB 1例的免疫組化染色結果

表2 無TBB垂體腺瘤患者與APA伴TBB患者腫瘤組織中CD34表達量的比較

t=11.160,P=0.025。

3 討論

APA是垂體腺瘤罕見的亞型，組織學上表現為良性，但生物學行為傾向于惡性，常侵犯周圍正常組織。APA發(fā)現時多為巨大腺瘤，易發(fā)生囊變、壞死，術中常發(fā)生TBB，不僅導致手術視野模糊，而且切除腫瘤時易損傷相鄰重要組織[7]。

CD34是血管內皮細胞特異的標記物，與血管生成密切相關。腫瘤的生長依賴于血管的生成，而其侵襲和浸潤等生物學行為必須以適宜的血液供應為前提。CD34陽性表達率越高，腫瘤形成新生血管的活躍程度越高，腫瘤的侵襲性越大[8]。既往研究[9]發(fā)現，CD34的陽性表達與垂體腺瘤的侵襲性密切相關。該研究中17例APA中除1例局限于鞍內生長且術中未發(fā)生TBB外，其余16例APA均突破蝶鞍呈侵襲性生長并伴有不同程度的TBB。16例APA伴TBB CD34表達量高于無TBB垂體腺瘤患者，尤其是在2例術中大量出血的APA中，CD34表達量更高。CD34的陽性表達提示腫瘤在侵襲生長過程中伴隨著大量新生血管的生成和血液供應的增加[10]，這與術中顯微鏡下觀察到瘤體及周邊大量不成熟血管組織的現象相一致。這些不成熟的血管導致術中出血量增加，止血困難，使得手術難度加大，全部切除腫瘤較為困難。其中1例APA在當地醫(yī)院因術中出血量較大而手術失敗，腫瘤未能切除，后轉至河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院行二次手術，選擇經顱入路后切除大部分腫瘤。因此，CD34作為血管內皮細胞的標記物具有較高的敏感性，不僅能夠反映APA的生物學行為，也可以作為評估APA術中發(fā)生TBB及判斷APA預后的重要指標。CD34表達量越高，APA術中發(fā)生的TBB越嚴重，手術完全切除腫瘤的難度就越大。

Ki-67作為一種細胞增殖周期調節(jié)蛋白在多種腫瘤組織中都有表達，是一項反映細胞增殖水平的常用指標。WHO 2004年提出以Ki-67 LI為3%作為區(qū)分APA和TPA的界值，因此APA免疫組化特征之一即為Ki-67 LI>3%[11]，該指標的增加意味著垂體腺瘤的生物學行為向惡性轉換，如生長速度加快、侵襲性增加等[12-13]。但目前還沒有關于Ki-67與APA發(fā)生TBB之間相關性的研究。該組17例APA的Ki-67 LI為3.2%～12.0%，發(fā)生嚴重TBB的2例APA的Ki-67 LI分別為8.8%和7.6%，說明Ki-67在術中發(fā)生出血的APA中并無過度表達，與APA發(fā)生TBB無相關性。

MRI是APA術前常規(guī)影像學檢查，能否利用MRI對TBB的發(fā)生進行預測尚不完全確定。該研究中，17例APA在MRI增強后顯著強化，提示腫瘤血供豐富，強化不均勻說明腫瘤內成分復雜，腫瘤內可發(fā)生囊變、壞死等。7例APA術前MRI表現為T1WI等信號，T2WI等-高信號且增強后顯著強化。5例APA術中發(fā)生輕到中度的TBB，2例術前MRI上發(fā)現腫瘤內大量不成熟流空血管影，增強后明顯強化，術中出現嚴重的TBB，出血量達1 000 mL以上。這些研究結果提示，APA的MRI影像學特征結合CD34表達情況，也許能夠判斷APA術中發(fā)生TBB的可能性及預測術中的出血量。

綜上所述，APA發(fā)生TBB與CD34的陽性表達有關，CD34可作為判斷APA術中發(fā)生TBB風險的有效參考指標。CD34的陽性表達和腫瘤富血供的MRI表現特點相結合有助于了解APA發(fā)生TBB的機制，指導TBB的治療，判斷和預測APA的預后。通過CD34抑制劑阻止腫瘤微血管的生成，降低TBB發(fā)生率，可能成為治療APA發(fā)生TBB的新策略，但還需要進一步的研究來證實。

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(2016-08-31收稿 責任編輯姜春霞)

Expressions of Ki-67 and CD34 in tissue from atypical pituitary adenoma with tumor bed bleeding

ZHANGLan1)，GUOFuyou2)

1)DepartmentofMRI,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000 2)DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

atypical pituitary adenoma;tumor bed blooding;Ki-67;CD34

Aim: To investigate the expression of CD34 in atypical pituitary adenoma(APA) tissue with tumor bed blooding(TBB) and its relationship with TBB. Methods: A total of 194 cases of pituitary adenomas accepting surgery were collected and the expressions of Ki-67 and CD34 were detected by immunohistochemical method. The clinical data, MRI manifestation and immunohistochemical features of 17 cases of APA were studied. The relationship between TBB during the operation and CD34 expression was analyzed.Results: The 17 APA were all macro-adenoma. Among them,14 APA with gross-total resection underwent few to moderate TBB during the operation and 2 APA with subtotal resection experienced severe TBB. Most MRI manifestations of APA were iso-intensity on T1WI and iso-hyperintensity on T2WI with obvious enhancement.Ki-67 LI of 17 cases of APA were 3.2%～12.0%. The positive expression values of CD34 were (26.8±7.7) and (10.6±5.3) in 16 cases of APA with TBB and pituitary adenomas without TBB(P=0.025). Conclusion: The combination of CD34 positive expression and hypervascular MRI manifestation helps to understand the mechanism of TBB, judge and predict the prognosis of APA.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.011

*國家自然科學基金資助項目 U1204807；河南省中醫(yī)藥科學研究專項課題 2015ZY02014

R736.4