miR-125b在頸動脈粥樣硬化患者外周血單個核細胞中的表達及其對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響*

謝 巖，任志文，趙 冬

1)新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院老干部科 新疆石河子 832008 2)新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院神經外科 新疆石河子 832008

miR-125b在頸動脈粥樣硬化患者外周血單個核細胞中的表達及其對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響*

謝 巖1)，任志文2)#，趙 冬2)

1)新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院老干部科 新疆石河子 832008 2)新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院神經外科 新疆石河子 832008

#通信作者，男，1978年8月生，碩士，主治醫師，研究方向：神經外科疾病，E-mail：9594986@qq.com

動脈粥樣硬化；miR-125b；平滑肌細胞；細胞增殖；細胞遷移

目的：探討miR-125b在頸動脈粥樣硬化(AS)患者外周血單個核細胞中的表達及對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響。方法：選取85例頸AS患者(不穩定性斑塊39例，穩定性斑塊46例)和45例健康者(對照組)，采用實時熒光定量PCR法檢測外周血單個核細胞中miR-125b的表達。培養人主動脈血管平滑肌細胞，分別轉染miR-125b 模擬物、miR-125b抑制物、miR-125b陰性對照，以不作任何處理的細胞為空白對照組，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中miR-125b的表達，MTT法檢測細胞增殖活性，Transwell細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力。結果：與對照組相比，AS患者外周血單個核細胞中miR-125b相對表達量降低，且不穩定性斑塊患者低于穩定性斑塊患者(P<0.05)。miR-125b模擬物組細胞中miR-125b相對表達量顯著高于陰性對照組和空白對照組，且miR-125b抑制物組低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；miR-125b模擬物組細胞增殖抑制率和細胞遷移數顯著低于陰性對照組和空白對照組，而miR-125b抑制物組則高于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。結論：miR-125b可能通過抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移而發揮保護動脈的作用。

近年來，隨著人們生活方式的改變，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發病率呈逐年上升趨勢，由此而導致的心腦血管疾病已成為威脅人類健康的重要公共衛生問題[1]。AS發生機制較為復雜，是血液成分、局部血流、血管細胞、細胞外基質、環境和遺傳等眾多因素相互作用的結果[2]，其中，血管內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖和炎癥反應是AS形成中的重要因素[3]。微小RNA(miRNA)作為一種內源性高度保守的短小RNA，已被證實參與了多種生理及病理過程[4]。有研究[5]指出，miRNA參與了AS的發生及進展，在調節平滑肌細胞增殖、內皮細胞功能及血細胞聚集中發揮重要作用。miR-125b作為miRNA的重要類型，主要表達于動脈血管平滑肌細胞中，可能參與了血管功能的調控[6]。該研究對miR-125b在頸AS患者外周血單個核細胞中的表達進行了分析，并且探討其對體外培養的主動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移能力的影響，以期為AS機制研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2015年3月在新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院住院的頸AS患者85例，男性56例，女性29例，年齡55～81(68.3±9.1)歲，患者血脂均升高，彩色多普勒超聲檢查顯示AS斑塊形成。排除重要臟器嚴重功能障礙者、腫瘤患者。同期，從體檢中心選取健康者45例作為對照，男性31例，女性14例，年齡55～79(67.9±8.8)歲，排除糖尿病、高血壓等慢性病患者、腫瘤患者、重要臟器嚴重功能障礙者，均行彩色多普勒超聲檢查排除AS。該研究通過醫院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。收集所有研究對象的年齡，性別，血壓，體重指數，空腹血糖(FBG)，血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)，尿酸等一般資料。根據頸動脈彩色多普勒超聲檢測[7]結果，將AS患者分為穩定性斑塊組和不穩定性斑塊組。其中，穩定性斑塊組46例，男性34例，女性12例，年齡55～78(68.1±8.9)歲；不穩定性斑塊組39例，男性22例，女性17例，年齡55～79(68.7±9.3)歲。

1.2 主要試劑及儀器 人淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司，Trizol總RNA提取試劑盒、Lipofectamine 2000轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，miR-125b及內參U6引物序列、miR-125b模擬物、miR-125b抑制物和陰性對照均由上海生工生物工程有限公司設計合成，人主動脈血管平滑肌細胞購自ATCC細胞庫，DMEM培養基、胎牛血清及胰酶均購自美國Gibco公司，MTT、DMSO均購自武漢博士德生物公司，Transwell小室購自美國BD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測外周血單個核細胞中miR-125b的表達 所有研究對象均晨起抽取空腹靜脈血10 mL，抗凝后加入人淋巴細胞分離液，利用密度梯度離心法對外周血單個核細胞進行分離，洗滌、提純，計數細胞，加入臺盼藍對細胞活力進行測定，以細胞活力>95%為合格，將細胞保存于-80 ℃冰箱。取單個核細胞，加入細胞裂解液裂解，用Trizol法提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行PCR。miR-125b引物序列上游：5’-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3’，下游：5’-GCT GTCAACATACGCTAGGTA-3’；內參U6引物序列上游：5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，下游：5’-CG GTTGGCTGGAAAGGAG-3’。反應體系：10×擴增緩沖液10 μL，dNTP混合物各200 μmol/L，引物各20 pmol，模板DNA 0.5 μg，Taq DNA聚合酶2.5 μL，Mg2+1.5 mmol/L，加雙蒸水至100 μL。PCR反應條件：94 ℃ 60 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，76 ℃ 30 s，連續進行42個循環，每個樣品均設置3個平行反應復孔。用2-ΔΔCt法計算miR-125b的相對表達量。

1.4 主動脈血管平滑肌細胞的培養及處理 用DMEM培養基培養人主動脈血管平滑肌細胞，待細胞融合度達到75%以上時，胰酶消化，傳代培養。調整細胞密度，接種于6孔板中(3×105/孔)，培養24 h，利用Lipofectamine 2000分別轉染細胞，根據轉染物不同分為：空白對照組(不作任何處理)，miR-125b 模擬物組(轉染miR-125b模擬物5’-UCCCU GAGACCCUAACUUGUGA-3’)，miR-125b抑制物組(轉染miR-125b抑制物5’-TCACAAGTTAGGGTCT CAGGGA-3’)，陰性對照組(轉染miR-125b陰性對照序列5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)。

1.5 實時熒光定量PCR檢測各組細胞中miR-125b的表達 各組細胞轉染48 h，加入細胞裂解液進行裂解，其余步驟同1.3。

1.6 MTT法檢測各組細胞增殖活性 轉染48 h后，取各組細胞，胰酶消化，用完全培養基(含體積分數10%胎牛血清)稀釋成細胞懸液，接種于96孔板中(5×103/孔)，每孔終體積200 μL，于恒溫培養箱中培養48 h，棄去培養液，洗滌3次，加入MTT液20 μL，避光培養4 h，加入DMSO 150 μL，在搖床上搖動10 min，上酶標儀于490 nm處測定吸光度(A)值，重復實驗3次。細胞增殖抑制率=(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.7 Transwell細胞遷移實驗檢測各組細胞遷移能力 轉染48 h后，取各組細胞，胰酶消化。取Transwell小室置于無菌24孔板中，將細胞加入上室(1×103/室)，將含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液加入下室，置于恒溫箱中培養24 h，用多聚甲醛對小室膜上細胞進行固定，用結晶紫染色2 min，于高倍鏡(×400)下觀察，隨機取5個視野計數穿膜細胞數，取均值。

1.8 統計學處理 采用SPSS 21.0處理數據，采用兩獨立樣本t檢驗或χ2檢驗比較對照組、AS穩定性斑塊組和不穩定性斑塊組一般資料及外周血單個核細胞中miR-125b表達的差異。采用單因素方差分析比較各組細胞miR-125b表達、增殖抑制率和穿膜細胞數的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對照組、穩定性斑塊組和不穩定性斑塊組一般資料及外周血單個核細胞中miR-125b表達的比較 結果見表1。

表1 對照組、穩定性斑塊組和不穩定性斑塊組一般資料及外周血單個核細胞中miR-125b表達比較

1 mmHg=0.133 kPa；*：與對照組比較，P<0.05；#：與穩定性斑塊組比較，P<0.05。

2.2 各組細胞中miR-125b表達的比較 miR-125b模擬物組細胞中miR-125b相對表達量高于陰性對照組和空白對照組，miR-125b抑制物組低于陰性對照組和空白對照組，見表2。

2.3 各組細胞增殖抑制率的比較 miR-125b模擬物組細胞增殖抑制率低于陰性對照組和空白對照組，miR-125b抑制物組高于陰性對照組和空白對照組，見表2。

2.4 各組細胞遷移能力比較 結果見表2和圖1。

表2 各組細胞中miR-125b相對表達量、細胞增殖抑制率及穿膜細胞數比較(n=3)

*：與陰性對照組和空白對照組相比，P<0.05；#：與miR-125b抑制物組相比，P<0.05。

A：miR-125b模擬物組；B：miR-125b抑制物組；C：陰性對照組；D：空白對照組。圖1 各組細胞遷移情況

3 討論

AS作為多種心腦血管疾病的共同病理基礎，病因多樣，發病機制較為復雜，涉及內皮細胞損傷、炎癥激活、平滑肌細胞增殖及遷移等多個病理過程[7]。有研究[8]指出，血管平滑肌細胞異常增殖、遷移在促進AS發生及進展中發揮重要作用。miRNA作為廣泛存在生物體內的保守的短小RNA，可調控多種細胞增殖、分化及凋亡過程[9]。研究[10]表明，在損傷后的血管平滑肌中miR-125b表達顯著下調。劉現梅等[11]指出，同型半胱氨酸通過促進miR-125b甲基化而促進血管平滑肌細胞增殖。外周血單個核細胞廣泛存在于人體，在炎癥反應、免疫功能方面發揮重要作用，可真實地反映機體的免疫狀況。考慮到炎癥反應參與了AS的發生及進展過程[12]，該研究對頸AS患者外周血單個核細胞中miR-125b表達進行了檢測，結果顯示，miR-125b在頸AS患者外周血單個核細胞中相對表達量低于對照組，且不穩定性斑塊組低于穩定性斑塊組，說明頸AS患者外周血單個核細胞中miR-125b表達下調，且與斑塊性質有關，提示miR-125b可能參與了頸AS的進展過程。

為進一步探討miR-125b參與AS發生的可能機制，作者分別對人主動脈血管平滑肌細胞轉染miR-125b模擬物、miR-125b抑制物和陰性對照，結果顯示，miR-125b模擬物組細胞中miR-125b相對表達量高于陰性對照組和空白對照組，且miR-125b抑制物組低于陰性對照組和空白對照組；miR-125b模擬物組細胞增殖抑制率顯著低于陰性對照組和空白對照組，而miR-125b抑制物組高于陰性對照組和空白對照組，說明特異性上調miR-125b可顯著抑制人主動脈血管平滑肌細胞增殖，而下調miR-125b則可促進細胞增殖，提示miR-125b可能參與了人主動脈血管平滑肌細胞增殖過程。有研究[13]指出，血管平滑肌細胞增殖在血管新生內膜形成中發揮關鍵性作用，提示miR-125b可能通過調控血管平滑肌增殖而參與血管相關生理病理過程。作者在該研究中還發現，miR-125b模擬物組細胞遷移能力顯著降低而miR-125b抑制物組則升高，說明上調miR-125b可抑制血管平滑肌細胞遷移，而下調其表達則可促進細胞遷移，提示上調miR-125b可能通過抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移而發揮抗AS的作用。

綜上所述，miR-125b在頸AS患者外周血單個核細胞中呈低表達，且與斑塊穩定性有關，miR-125b可能通過抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移而發揮保護動脈的作用，從而減少AS的發生。miR-125b有望成為AS診斷和臨床治療的新靶位。

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(2016-08-30收稿 責任編輯李沛寰)

Expression of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells of patients with atherosclerosis and its effects on proliferation and migration of smooth muscle cells

XIEYan1),RENZhiwen2),ZHAODong2)

1)DepartmentofVeteranCadres,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832008 2)DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832008

atherosclerosis;miR-125b;smooth muscle cell;cell proliferation;cell migration

Aim: To investigate the expressions of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells in patients with atherosclerosis(AS) and its effect on smooth muscle cells. Methods: A total of 85 patients with carotid AS and 45 healthy individuals(control group) were selected. The expression of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells were detected by real-time quantitative PCR. The human vascular smooth muscle cells were cultured and were transfected with miR-125b mimics, miR-125b inhibitor, miR-125b negative control, respectively, and cells without any treatment were the blank control group. The expression of miR-125b in the above 4 groups was detected by real-time quantitative PCR, the cell proliferation activity was detected by MTT assay, and the cell migration was detected by transwell cell migration assay. Results: Compared with the control group, the relative expression level of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells of AS group was decreased, and which was lower in the unstable plaques patients than that in the stable plaque patients(P<0.05). The relative expression level of miR-125b in miR-125b mimics group was significantly higher than those in the miR-125b inhibitor group, negative control group and blank control group, and that in the miR-125b inhibitor group was lower than those in the negative control group and the blank control group(P<0.05). The cell proliferation inhibition rate and the number of migration cells in miR-125b mimics group were significantly lower than those in the other 3 groups, while those in miR-125b inhibitor group were higher than those in the negative blank control group and the blank control group(P<0.05). Conclusion: The expressions of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells in carotid AS patients is low, and is related with the plaque stability. miR-125b has protective effects against AS through inhibit the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.013

*國家自然科學基金資助項目 81360185

R543.4