DNMT3A R882位點(diǎn)突變急性髓系白血病臨床分析

高 展，劉延方#，王 沖，周 陽，朱穎超，徐 衍，董 麗，侯 杰，仝佳音，劉若陽，侯降雪，李 濤，張秋堂，孫 慧，孫 玲，萬鼎銘

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病研究室 鄭州 450052

DNMT3A R882位點(diǎn)突變急性髓系白血病臨床分析

高 展1)，劉延方1)#，王 沖1)，周 陽1)，朱穎超1)，徐 衍1)，董 麗1)，侯 杰1)，仝佳音1)，劉若陽1)，侯降雪1)，李 濤2)，張秋堂2)，孫 慧1)，孫 玲1)，萬鼎銘1)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病研究室 鄭州 450052

#通信作者，男，1962年5月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：血液病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：liuyf371@163.com

急性髓系白血病；DNMT3A R882位點(diǎn)突變；臨床特征

目的：分析DNMT3A R882位點(diǎn)突變急性髓系白血病(AML)患者的臨床特征。方法：選取接受DNMT3A R882位點(diǎn)突變檢測(cè)的168例初治AML患者，采用PCR聯(lián)合基因測(cè)序法檢測(cè)DNMT3A R882位點(diǎn)突變以及CEBPA、NPM1和FLT3-ITD突變，采用4色多參數(shù)流式細(xì)胞儀分析18種抗原在白血病細(xì)胞上的表達(dá)，K-M法繪制生存曲線用于預(yù)后分析。 結(jié)果：共檢出24例(14.29%)DNMT3A R882位點(diǎn)突變的AML患者。DNMT3A R882位點(diǎn)突變與未突變者比較，患者表現(xiàn)為高齡，發(fā)病時(shí)白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)高，CD33和CD11b陽性率較高，CD34陽性率較低，易合并NPM1及FLT3-ITD基因突變；第一療程誘導(dǎo)化療后完全緩解率與未突變組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但中位無事件生存時(shí)間縮短(62 dvs277 d)。 結(jié)論：DNMT3A R882位點(diǎn)突變的AML具有較顯著的臨床特征，預(yù)后差。

表觀遺傳學(xué)通路上的分子事件異常與急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，屬于AML相關(guān)的分子學(xué)異常中的Ⅲ類基因突變[1]。表觀遺傳學(xué)在非基因序列改變基礎(chǔ)上引起基因表達(dá)水平的改變，包括DNA甲基化和組蛋白修飾等[2]，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，通過與DNA的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)位點(diǎn)結(jié)合，從而使CpG發(fā)生甲基化修飾[3]。約22%的AML患者存在DNMT3A基因突變[4]，其中R882位點(diǎn)突變提示預(yù)后不良[5-8]。該研究回顧性分析了168例初治AML患者中DNMT3A基因R882位點(diǎn)突變的檢出率，分析DNMT3A R882位點(diǎn)突變的AML患者的臨床特征。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例來源 從2015年1月至2016年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院初治的AML患者中選取實(shí)驗(yàn)室檢查資料完整、接受DNMT3A R882位點(diǎn)基因突變檢測(cè)者168例，剔除急性混合型白血病和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室資料不完整者。診斷參照WHO標(biāo)準(zhǔn)[9]和張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[10]。168例AML患者，男82例，女86例，年齡14～75歲；其中FAB分型M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7分別有4例、5例、74例、28例、21例、33例、3例和0例。

1.2 免疫表型分析 采用4色多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD13、CD33、CD117、CD64、CD14、CD11b、CD58、CD38、CD4、CD7、CD34、CD25、CD15、CD56、CD71、CD123、HLA-DR及cMPO等18種抗原在白血病細(xì)胞中的表達(dá)，以CD45/SSC設(shè)門分析白血病細(xì)胞免疫表型，抗原表達(dá)率≥20%為陽性表達(dá)，計(jì)算抗原陽性的患者比例。

1.3 基因突變檢測(cè) 檢測(cè)以下基因：DNMT3A、CEBPA、NPM1和FLT3-ITD。取血樣經(jīng)PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序。PCR檢測(cè)儀為ABI Gene Amp*PCR System 9700，自動(dòng)化基因分析儀為ABI 3130，試劑為上海源奇生物科技有限公司提供的白血病預(yù)后基因檢測(cè)試劑盒(測(cè)序法)。

1.4 治療及隨訪 AML診斷明確后給予IA/DA/MA等(3+7)方案誘導(dǎo)化療，并重復(fù)1個(gè)療程，達(dá)到完全緩解后給予HD-Ara-C強(qiáng)化治療4個(gè)療程，然后給予維持治療。療效判定標(biāo)準(zhǔn)參照WHO標(biāo)準(zhǔn)[9]。168例患者隨訪至2016年4月1日或發(fā)生終點(diǎn)事件，隨訪時(shí)間22～455 d，觀察患者第一療程完全緩解率和無事件生存情況。終點(diǎn)事件包括死亡、疾病進(jìn)展、治療失敗、復(fù)發(fā)、改換治療方案等種種情況。 無事件生存定義為從疾病確診開始至未發(fā)生任何終點(diǎn)事件。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。突變和未突變AML患者臨床特征的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，兩組免疫表型及突變檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法，采用Kaplan-Meier法繪制兩組的生存曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DNMT3A R882位點(diǎn)突變檢出率 168例AML患者中24例(14.29%)檢測(cè)到DNMT3A R882位點(diǎn)突變，其中常見的雜合子錯(cuò)義突變R882H和R882C突變各12例。DNMT3A R882位點(diǎn)突變患者合并AML常見其他類型基因突變情況見表1。

表1 168例AML患者DNMT3A R882位點(diǎn)突變與其他基因突變的關(guān)系 例(%)

2.2 DNMT3A R882位點(diǎn)突變和未突變患者臨床特征的比較 見表2。突變組的平均年齡高于未突變組，且發(fā)病時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)顯著高于未突變組。在M0、M2、M4和M5型患者中分別有2例(8.3%)、7例(29.2%)、5例(20.8%)和10例(41.7%)檢測(cè)到DNMT3A R882位點(diǎn)突變；在M1、M3、M6型患者中均未檢測(cè)到。

2.3 DNMT3A R882位點(diǎn)突變和未突變患者免疫表型的比較 見表3。突變組CD33和CD11b陽性患者比例高于未突變組，而CD34陽性患者比例低于未突變組。兩組所檢測(cè)的其他抗原陽性患者比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 DNMT3A R882位點(diǎn)突變和未突變患者的治療反應(yīng) 第一療程誘導(dǎo)化療后，突變組完全緩解14例(58.33%)，未突變組完全緩解72例(50.00%)，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.572，P=0.450)。兩組生存曲線見圖1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.478，P=0.034)，突變組中位無事件生存時(shí)間(162 d)短于未突變組(277 d)。

表2 DNMT3A R882位點(diǎn)突變與未突變者臨床特征比較

*:精確概率；#:資料非正態(tài)分布，以M(P25～P75)表示。

表3 DNMT3A R882位點(diǎn)突變和未突變患者免疫表型的比較 例(%)

△：校正χ2；*：精確概率。

圖1 K-M生存曲線

3 討論

異常的DNA甲基化可干擾整個(gè)基因組穩(wěn)定，誘導(dǎo)miRNA異常調(diào)節(jié)，干擾生長(zhǎng)信號(hào)，增加細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[11]，在AML發(fā)生中起著舉足輕重的作用。DNMT3A是DNMT3家族的一員，突變有R882、R478W、V897D、G543C，其中R882位點(diǎn)突變最常見[1]。該研究結(jié)果表明，部分AML患者(14.29%)存在DNMT3A R882位點(diǎn)突變，這些患者就診時(shí)年齡大、白細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù)均高于未突變組，與國(guó)外研究[5，12]結(jié)果一致；DNMT3A R882位點(diǎn)突變多見于M5型，患者高表達(dá)抗原CD33和CD11b，其中CD11b為單核細(xì)胞特異性表面標(biāo)志[13]，與“DNMT3A R882位點(diǎn)突變多見于M5型”結(jié)果[1，6]一致。以上結(jié)果提示，存在DNMT3A R882位點(diǎn)突變的AML可能具有某種臨床特征，分析其臨床特征有助于早期識(shí)別該類患者。

該組資料還發(fā)現(xiàn)，DNMT3A R882位點(diǎn)突變的AML患者第一療程誘導(dǎo)化療后完全緩解率與未突變者間比較雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但突變者中位無事件生存時(shí)間卻短于未突變者，提示 DNMT3A R882位點(diǎn)突變可能不影響誘導(dǎo)緩解治療的療效，但易引起AML細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)發(fā)，影響患者生存，是AML預(yù)后危險(xiǎn)因素[5-8]。DNMT3A R882位點(diǎn)突變的AML患者NPM1及FLT3-ITD突變檢出率高于未突變者。NPM1屬于轉(zhuǎn)錄因子，而FLT3-ITD屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[1]，兩者作用于不同的通路途徑。DNMT3A作為表觀遺傳學(xué)中的一個(gè)重要分子參與人體內(nèi)癌基因和抑癌基因的調(diào)節(jié)。這3種基因在AML患者中同時(shí)突變，可能與AML的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，也可能是AML患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，需要進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，DNMT3A R882位點(diǎn)突變是DNMT3A突變?cè)贏ML中的主要形式，存在DNMT3A R882位點(diǎn)突變的AML患者表現(xiàn)為高齡，發(fā)病時(shí)白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)高，高表達(dá)CD33和CD11b，弱表達(dá)CD34，易合并NPM1及FLT3-ITD基因突變，DNMT3A R882位點(diǎn)突變提示預(yù)后不良。

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(2016-09-12收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Clinical characteristics of acute myeloid leukemia with DNMT3A R882 mutation

GAOZhan1),LIUYanfang1),WANGChong1),ZHOUYang1),ZHUYingchao1),XUYan1),DONGLi1),HOUJie1),TONGJiayin1),LIURuoyang1),HOUJiangxue1),LITao2),ZHANGQiutang2),SUNHui1),SUNLing1),WANDingming1)

1)DepartmentofHematology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)InstituteofHematology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

acute myeloid leukemia; DNMT3A R882 mutation; clinical characteristics

Aim: To explore the clinical characteristics of acute myeloid leukemia(AML) with DNMT3A R882 mutation. Methods: The clinical data of 168 AML patients undergoing detection of DNMT3A R882 loci mutation were collected retrospectively. Gene sequencing after PCR was used to detect the DNMT3A R882 loci mutation,as well as CEBPA, NPM1 and FLT3-ITD mutations. The expressions of 18 antigens on leukemic blasts were assessed by 4 color flow cytometry. The prognosis was analyzed using K-M curve.Results: DNMT3A R882 mutation was detected in 24 patients(14.29%). Compared with the patients without DNMT3A R882 mutation, the patients with DNMT3A R882 mutation tended to be more older, with higher white blood and platelet counts, with higher expressions of CD33 and CD11b and poorer expression of CD34, and more companied with NPM1 and FLT3-ITD mutations. The patients with DNMT3A R882 mutation had a shorter median event-free survival time than those without(62 dvs277 d), but there was no significant difference in complete response rate after the first course of treatment.Conclusion: The AML patients with DNMT3A R882 mutation have obvious clinical features and a poor prognosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.014

R733.71