妊娠早期稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中HIF-1α、BNIP3、LC3的表達(dá)*

袁恩武，王銀芳，邢金芳，閆廣偉，孫利環(huán)，代延朋

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院圍產(chǎn)保健科 鄭州 450052

妊娠早期稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中HIF-1α、BNIP3、LC3的表達(dá)*

袁恩武1)△，王銀芳1)，邢金芳1)，閆廣偉1)，孫利環(huán)2)，代延朋1)

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院圍產(chǎn)保健科 鄭州 450052

△男，1967年12月生，碩士，主任技師，教授，研究方向：臨床生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：yuanenwu@126.com

稽留流產(chǎn)；絨毛組織；自噬；HIF-1α；BNIP3；LC3

目的：檢測妊娠早期稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中HIF-1α、BNIP3、LC3的表達(dá)，探討滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬異常與稽留流產(chǎn)的關(guān)系。方法：收集正常早孕婦女及稽留流產(chǎn)婦女絨毛組織各30例，采用實時熒光定量PCR法檢測HIF-1α、BNIP3 mRNA的表達(dá)；采用免疫組化SP法及蛋白印跡法檢測HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：兩組絨毛組織中均可見HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白的表達(dá)，HIF-1α主要定位于滋養(yǎng)細(xì)胞胞核及胞質(zhì)，BNIP3及LC3主要定位于滋養(yǎng)層細(xì)胞胞質(zhì)中。與正常早孕組相比，稽留流產(chǎn)組HIF-1α與BNIP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及LC3Ⅱ/Ⅰ均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論：絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中HIF-1α/BNIP3信號通路調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬水平下降可能是稽留流產(chǎn)發(fā)生的重要機(jī)制。

稽留流產(chǎn)又稱過期流產(chǎn)，指宮內(nèi)胚胎或胎兒死亡之后未能及時自然排出[1]，是流產(chǎn)的一種特殊形式。目前稽留流產(chǎn)在我國的發(fā)生率高達(dá)13.4%[2]，隨著國家二孩生育政策的放開,高齡孕婦的增加,其發(fā)病率有逐年增加的趨勢，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。妊娠期間，母胎界面是母體與胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換的重要器官，而界面上的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞是承擔(dān)其功能并維持屏障作用的主要細(xì)胞，其功能障礙與妊娠結(jié)局密切相關(guān)。在妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞處于相對缺氧的環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)增加。研究[3]顯示已知或未知病因可顯著降低孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，使其不能耐受低氧環(huán)境，導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生，但具體機(jī)制仍不明確。缺氧環(huán)境可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，HIF-1α/BNIP3和AMPK/mTOR是低氧誘導(dǎo)自噬的兩條信號通路[4]，并且HIF-1α/BNIP3是主要通路[5]。自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解蛋白質(zhì)、大分子物質(zhì)及其他細(xì)胞成分的過程，是一種高度保守的細(xì)胞降解過程，在所有真核生物細(xì)胞中普遍存在，當(dāng)缺氧、營養(yǎng)不足及損傷時作為一種應(yīng)激反應(yīng)出現(xiàn)。通常用LC3Ⅱ/Ⅰ來表示自噬水平[6]，比值降低表示自噬活性減弱，反之表示自噬活性增強(qiáng)。自噬在防治腫瘤[7]、神經(jīng)退行性疾病[8]、心血管疾病[9]、糖尿病[10]、器官移植[11]等方面有積極作用。該研究以稽留流產(chǎn)孕婦絨毛組織為研究對象，對HIF-1α/BNIP3信號通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測，初步探討自噬在稽留流產(chǎn)中的作用，進(jìn)一步為稽留流產(chǎn)的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年10月至2016年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科經(jīng)B超及β-hCG動態(tài)監(jiān)測結(jié)合臨床證實為稽留流產(chǎn)的患者30例，年齡20～45(20.0±3.5)歲，孕齡49～63(58.7±8.6) d；選取同期經(jīng)B超證實為活胎、因非意愿妊娠行人工流產(chǎn)術(shù)的正常早孕婦女30例，年齡20～45(30.1±5.2)歲，孕齡49～63(62.9±12.6) d。兩組孕婦均為單胎，既往均無高血壓、糖尿病及甲狀腺功能亢進(jìn)等其他全身性疾病病史，無吸煙、長期服用藥物史，抗核抗體、抗心磷脂抗體、抗精子抗體、抗內(nèi)膜抗體、抗卵巢抗體檢查無異常，風(fēng)疹病毒IgM、巨細(xì)胞病毒IgM、單純皰疹病毒IgM、弓形蟲IgM、生殖道支原體、衣原體檢查無異常，生殖器解剖結(jié)構(gòu)無異常，絨毛染色體檢查無異常，孕期無急、慢性感染性疾病。該研究均獲所有研究對象知情同意，且已經(jīng)過該院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 于人工流產(chǎn)術(shù)后3 min內(nèi)，快速收集患者絨毛組織并用無菌生理鹽水沖洗干凈。將絨毛分為3份，1份置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中，固定24 h后行脫水、石蠟包埋及切片；另2份置于高壓滅菌凍存管，并迅速放入液氮罐中，過夜后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測絨毛組織中HIF-1α、BNIP3 mRNA的表達(dá) 取凍存絨毛組織約50 mg，于研缽中加入液氮研磨成粉末，采用Trizol法提取總RNA，檢測總RNA的完整性、濃度及純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo公司產(chǎn)品)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，熒光染料SYBR Green 10.0 μL，加滅菌蒸餾水6.4 μL至總體積20 μL。以無RNA酶的水代替cDNA模板作陰性對照，樣品及陰性對照均設(shè)3個復(fù)孔。每管混勻離心后置于實時熒光定量PCR儀中，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s；60 ℃退火延伸1 min，共40個循環(huán)。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成(表1)。記錄擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以測定樣品擴(kuò)增的特異性。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個樣本的循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列及其擴(kuò)增片段大小

1.4 免疫組化SP法檢測絨毛組織中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表達(dá) 取絨毛組織切片，實驗步驟按SP 法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)說明書進(jìn)行。兔抗人HIF-1α、BNIP3單克隆抗體(英國Abcam公司產(chǎn)品)及兔抗人LC3單克隆抗體(美國CST公司產(chǎn)品)均稀釋100倍使用。用PBS代替一抗作為陰性對照。最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫色，中性樹膠封片，于高倍鏡下觀察染色情況。以細(xì)胞胞核和(或)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞。

1.5 蛋白印跡法檢測絨毛組織中HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白的表達(dá) 組織蛋白的提取：取約100 mg絨毛組織，在加入液氮的研缽中研磨成粉末后移入勻漿器中，并加入1 mL組織裂解液及10 μL苯甲基磺酰氟(PMSF),置于冰上裂解30 min后進(jìn)行超聲破碎，4 ℃ 14 000 r/min離心5 min，取上清，檢測蛋白濃度，進(jìn)行蛋白變性后置于-20 ℃保存待用。檢測HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白：分別配制80、150 g/L分離膠及40 g/L凝縮膠，待膠凝固后行SDS-PAGE電泳，蛋白上樣量均為50 mg,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(美國PALL公司產(chǎn)品)上，用50 g/L脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后分別加入HIF-1α、BNIP3單克隆抗體(稀釋度為1:500，美國Abcam公司產(chǎn)品)、兔抗人LC3單克隆抗體(稀釋度為1:400，美國CST公司產(chǎn)品)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋度為1:5 000，英國Abcam公司產(chǎn)品)，4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入羊抗兔IgG二抗及羊抗鼠IgG二抗(稀釋度為1:4 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，37 ℃孵育1 h后洗膜，使用Odyssey Clx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對目的條帶的灰度值進(jìn)行分析，用目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平，計算LC3Ⅱ與LC3 Ⅰ蛋白相對表達(dá)水平的比值(LC3Ⅱ/Ⅰ)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行分析，兩組絨毛組織中HIF-1α、BNIP3 mRNA和蛋白表達(dá)，以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組絨毛組織中HIF-1α、BNIP3 mRNA的表達(dá)水平 見表2。稽留流產(chǎn)組絨毛組織中BNIP3 mRNA表達(dá)水平低于正常早孕組。

表2 2組絨毛組織中HIF-1α、BNIP3 mRNA的表達(dá)

2.2 兩組絨毛組織中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白表達(dá) 免疫組化SP檢測結(jié)果(圖1)顯示， 兩組絨毛組織合體滋養(yǎng)層細(xì)胞與細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中均可見HIF-1α、BNIP3及LC3的陽性表達(dá)，HIF-1α蛋白主要定位于滋養(yǎng)層細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中，BNIP3及LC3蛋白主要定位于滋養(yǎng)層細(xì)胞胞質(zhì)中。 蛋白印跡法檢測結(jié)果見圖2、表3。

A:正常早孕組;B:稽留流產(chǎn)組;1:HIF-1α蛋白；2：BNIP3蛋白；3：LC3蛋白。圖1 兩組絨毛組織中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表達(dá)(SP，×400)

1:正常早孕組；2:稽留流產(chǎn)組。圖2 兩組絨毛組織中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表達(dá)

表3 兩組絨毛組織中HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/Ⅰ的比較

3 討論

在妊娠早期,母胎循環(huán)建立之前，滋養(yǎng)層細(xì)胞處于相對缺氧的環(huán)境中，缺氧對滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化及侵襲具有重要的調(diào)節(jié)作用。有研究[12]顯示，在早期妊娠中胎盤氧濃度僅2%，作為氧平衡的重要調(diào)節(jié)因子，HIF-1α的表達(dá)在正常妊娠過程中于孕7～9周時達(dá)到高峰，之后便開始下降[13]，HIF-1α的高表達(dá)可使胚胎耐受低氧環(huán)境，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育，對于調(diào)節(jié)胎盤形態(tài)、血管生成及滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)局具有重要作用[14]。該研究選取妊娠早期的絨毛組織進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞胞核與胞質(zhì)中，同時稽留流產(chǎn)組絨毛組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)水平顯著低于正常早孕組，與以往研究[15]結(jié)果一致。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，3%氧濃度下JEG細(xì)胞的侵襲及遷移能力相較于常氧條件下顯著增強(qiáng)；Koklanaris等[17]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在低氧條件下，HTR-8 /SVneo細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)明顯升高；孕早期低氧環(huán)境可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，促進(jìn)胎盤中血管的生成。以上研究提示，低氧對于滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移及血管生成起著積極的促進(jìn)作用，這對于妊娠早期正常妊娠的維持起重要作用。在妊娠早期，HIF-1α蛋白表達(dá)下降，可能通過影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移及血管生成，參與胎盤功能障礙及稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展。

BNIP3表達(dá)受HIF-1α依賴的缺氧的調(diào)節(jié)，屬于促凋亡蛋白，主要定位于線粒體外膜。近年來，BNIP3在自噬、腫瘤進(jìn)展及化療耐藥方面的研究越發(fā)受到關(guān)注。Burton等[18]發(fā)現(xiàn)沉默BNIP3后導(dǎo)致依賴BNIP3的細(xì)胞自噬降低；Bellot等[19]也證實依賴HIF-1α誘導(dǎo)的BNIP3高表達(dá)是低氧誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵；Liang等[20]發(fā)現(xiàn)BNIP3可通過將Beclin-1從Beclin-1/Bcl-2復(fù)合體解離釋放，從而激活自噬。該研究結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)絨毛組織中BNIP3蛋白的表達(dá)下降，提示BNIP3在低氧誘導(dǎo)自噬途徑中具有重要作用。BNIP3作為促凋亡蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也可通過自噬，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活[21]，其含量的變化可影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的生存結(jié)局，進(jìn)而導(dǎo)致不良妊娠的發(fā)生。

LC3是自噬的重要標(biāo)志物，存在于自噬體的膜上，當(dāng)自噬形成時，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ,因此LC3Ⅱ/Ⅰ可以表示自噬水平的高低[6]。有研究[22]表明，在胎盤組織中自噬作為應(yīng)對環(huán)境壓力的重要途徑，可通過抑制凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活，可通過促進(jìn)細(xì)胞存活維持滋養(yǎng)細(xì)胞完整性，保護(hù)胎兒免受病毒感染；同時研究[23]發(fā)現(xiàn)具有自噬缺陷的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，且血管重建受到抑制，導(dǎo)致血管生成不足，加重其缺氧應(yīng)激狀態(tài)。該研究顯示稽留流產(chǎn)組絨毛組織中LC3Ⅱ/Ⅰ較正常早孕組降低，表明其自噬水平下調(diào)，提示在低氧環(huán)境中，稽留流產(chǎn)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬減弱，使其不足以應(yīng)對低氧環(huán)境帶來的一系列壓力，從而發(fā)生稽留流產(chǎn)。

綜上所述，低氧可以通過HIF-1α/BNIP3信號通路誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生自噬，且低氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬水平下降可能參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展。作者的研究結(jié)果為進(jìn)一步探索稽留流產(chǎn)的機(jī)制和尋求有效防治提供了新的思路。

[1]梁雨,李娜,徐紅梅,等.熒光原位雜交技術(shù)在稽留流產(chǎn)和死胎組織染色體檢測中的應(yīng)用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2012,38(1):127

[2]張慧君.稽留流產(chǎn)危險因素流行病學(xué)分析[J].中國病案,2012,13(8):71

[3]JAUNIAUX E,WATSON A,BURTON G.Evaluation of respiratory gases and acid-base gradients in human fetal fluids and uteroplacental tissue between 7 and 16 weeks' gestation[J].Am J Obstet Gynecol,2001,184(5):998

[4]RUEDA-CLAUSEN CF,MORTON JS,DAVIDGE ST.Eff- ects of hypoxia-induced intrauterine growth restriction on cardiopulmonary structure and function during adulthood[J].Cardiovasc Res,2009,81(4):713

[5]CHOI JH,LEE HJ,YANG TH,et al.Effects of hypoxia inducible factors-1α on autophagy and invasion of trophoblasts[J].Clin Exp Reprod Med,2012,39(2):73

[6]OH SY,CHOI SJ,KIM KH,et al.Autophagy-related proteins, LC3 and Beclin-1, in placentas from pregnancies complicated by preeclampsia[J].Reprod Sci,2008,15(9):912

[7]CAREW JS,KELLY KR,NAWROCKI ST.Autophagy as a target for cancer therapy: new developments[J].Cancer Manag Res,2012,4:357

[8]SCHAEFFER V,LAVENIR I,OZCELIK S,et al.Stimulation of autophagy reduces neurodegeneration in a mouse model of human tauopathy[J].Brain,2012,135(Pt 7):2169

[9]LIAO X,SLUIMER JC,WANG Y,et al.Macrophage autophagy plays a protective role in advanced atherosclerosis[J].Cell Metab,2012,15(4):545

[10]GONZALEZ CD,LEE MS,MARCHETTI PA,et al.The emerging role of autophagy in the pathophysiology of diabetes mellitus[J].Autophagy,2011,7(1):2

[11]王繞繞,宋紅麗.自噬在器官移植免疫耐受研究中的進(jìn)展[J].實用器官移植電子雜志,2016,4(1):57

[12]SAITO S,NAKASHIMA A.A review of the mechanism for poor placentation in early-onset preeclampsia: the role of autophagy in trophoblast invasion and vascular remodeling[J].J Reprod Immunol,2014,101:80

[13]ZHU LJ,CHEN YP,CHEN BJ,et al.Changes in reactive oxygen species, superoxide dismutase, and hypoxia-inducible factor-1α levels in missed abortion[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(8):2179

[14]COWDEN DAHL KD,FRYER BH,MACK FA,et al.Hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha regulate trophoblast differentiation[J].Mol Cell Biol,2005,25(23):10479

[15]米春梅,周昌菊,薛敏,等.HIF-1α和AAH在稽留流產(chǎn)患者絨毛中的表達(dá)研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2009,34(5):515

[16]WANG L,YU Y,GUAN H,et al.67-kDa Laminin receptor contributes to hypoxia-induced migration and invasion of trophoblast-like cells by mediating matrix metalloproteinase-9[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2015,42(5):549

[17]KOKLANARIS N,NWACHUKWU JC,HUANG SJ,et al.First-trimester trophoblast cell model gene response to hypoxia[J].Am J Obstet Gynecol,2006,194(3):687

[18]BURTON TR,GIBSON SB.The role of Bcl-2 family member BNIP3 in cell death and disease: NIPping at the heels of cell death[J].Cell Death Differ,2009,16(4):515

[19]BELLOT G,GARCIA-MEDINA R,GOUNON P,et al.Hypoxia-induced autophagy is mediated through hypoxia-inducible factor induction of BNIP3 and BNIP3L via their BH3 domains[J].Mol Cell Biol,2009,29(10):2570

[20]LIANG XH,JACKSON S,SEAMAN M,et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1[J].Nature,1999,402(6762):672

[21]SHI RY,ZHU SH,LI V,et al.BNIP3 interacting with LC3 triggers excessive mitophagy in delayed neuronal death in stroke[J].CNS Neurosci Ther,2014,20(12):1045

[22]BILDIRICI I,LONGTINE MS,CHEN B,et al.Survival by self-destruction: a role for autophagy in the placenta?[J].Placenta,2012,33(8):591

[23]NAKASHIMA A,YAMANAKA-TATEMATSU M,FUJITA N,et al.Impaired autophagy by soluble endoglin, under physiological hypoxia in early pregnant period, is involved in poor placentation in preeclampsia[J].Autophagy,2013,9(3):303

(2016-09-26收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expressions of HIF-1α,BNIP3,LC3 in villi from with women early pregnancy missed abortion

YUANEnwu1),WANGYinfang1),XINGJinfang1),YANGuangwei1),SUNLihuan2),DAIYanpeng1)

1)DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofPerinatalHealth,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

missed abortion；villous tissue；autophagy；HIF-1α；BNIP3；LC3

Aim: To investigate the expressions of HIF-1α,BNIP3,LC3 in villous tissue from with women early pregnancy missed abortion and the relationship between the abnormal autophagy in trophoblast cells and missed abortion. Methods: Villous tissue from healthy women with normal pregnancy(n=30) and women with missed abortion(n=30) were collected. RT-PCR was utilized to measure the expression levels of HIF-1α,BNIP3 mRNA; immunohistochemical SP method and Western blot were performed to determine the position and expression levels of HIF-1α,BNIP3 and LC3 Ⅱ/Ⅰprotein in villous tissue.Results: HIF-1α,BNIP3 and LC3 could be found in villous tissue from the two groups by immunochemical staining; HIF-1α was mainly localized in the nucleus and cytoplasm of trophoblast cells, BNIP3 and LC3 were mainly located in the cytoplasm of trophoblast cells. The mRNA expression of BNIP3 and protein expression levels of HIF-1α,BNIP3 and LC3Ⅱ/Ⅰ were significantly lower in villous tissue from missed abortion group than those from the normal control group(P<0.05). Conclusion: Autophagy mediated by HIF-1α/BNIP3 signaling pathway in the villous trophoblast cells may be the important mechanism of the occurrence of missed abortion.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.023

*河南省科技廳創(chuàng)新團(tuán)隊項目 20140269

R714.2