抑制自噬對貝伐單抗誘導的結腸癌HCT116細胞凋亡的影響

柴 婷，任 爽，張燕燕，匡 菁，楊家梅

鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科 鄭州 450014

抑制自噬對貝伐單抗誘導的結腸癌HCT116細胞凋亡的影響

柴 婷，任 爽，張燕燕，匡 菁，楊家梅#

鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科 鄭州 450014

#通信作者，女，1965年12月生，碩士，主任醫師，研究方向：腫瘤化療，E-mail：yjm6601@163.com

自噬；貝伐單抗；結腸癌；凋亡

目的：探討抑制自噬對貝伐單抗誘導的結腸癌HCT116細胞凋亡的影響。方法：用貝伐單抗、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理人結腸癌HCT116細胞48 h，Annexin V-FITC染色、流式細胞術檢測細胞凋亡，吖啶橙染色、熒光顯微鏡觀察細胞酸性自噬泡的變化，Western blot法檢測細胞內自噬相關蛋白Beclin-1以及凋亡相關蛋白Caspase-9的表達。結果：貝伐單抗作用48 h對HCT116細胞的半數抑制劑量(IC50)為16 mg/L，3-MA的IC50為5 mmol/L。在此濃度下，3-MA單獨作用可降低細胞中Beclin-1的表達，貝伐單抗單獨作用可增強細胞中Beclin-1的表達，二者聯用有拮抗作用(P<0.05)。3-MA和貝伐單抗單獨作用均可提高細胞凋亡率(P<0.05)，增強細胞中Caspase-9蛋白的表達(P<0.05)，二者聯用有協同作用(P<0.05)。結論：抑制自噬可增強貝伐單抗對結腸癌HCT116細胞的殺傷作用。

貝伐單抗是靶向血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的單克隆抗體，可以明顯抑制腫瘤組織新生血管的形成，從而造成旺盛生長的腫瘤細胞的供血不足，導致腫瘤細胞缺血、缺氧[1]。自噬是腫瘤細胞對抗各種抗腫瘤作用的有效手段，通過降解受損的腫瘤細胞細胞器、大分子蛋白質，給腫瘤細胞提供生物合成所需的分子底物，幫

助其應對惡劣的生存環境并維持細胞的穩態。特別是在腫瘤化療過程中，自噬能夠通過隔離并降解被藥物破壞的蛋白或細胞器，保護細胞并對抗化療藥物，降低化療藥物的療效[2-5]。該研究中，作者用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和貝伐單抗單獨或聯合作用于結腸癌HCT116細胞，觀察抑制自噬對貝伐單抗誘導的HCT116細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HCT116細胞株由河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室凍存。貝伐單抗購自Roche公司，3-MA、膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒均購自凱基生物科技發展有限公司，胎牛血清購自四季青生物工程材料有限公司，MTT購自Sigma公司，RPMI 1640及胰蛋白酶消化液購自Solarbio公司， Beclin-1及Caspase-9多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 貝伐單抗和3-MA作用濃度的篩選 配制0、4、8、16、32、64 mg/L的貝伐單抗溶液及0.0、1.0、2.5、5.0、7.0、10.0 mmol/L的3-MA溶液，均用dH2O稀釋。HCT116細胞復蘇后用RPMI 1640培養基于37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度條件下培養，每3 d更換培養液1次，使用胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期細胞，調細胞密度為1×108L-1，接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL,連續培養24 h后棄培養液，分別加入100 μL不同濃度的貝伐單抗溶液或3-MA溶液作用24、48、72 h，然后MTT法檢測細胞生長抑制率，酶標儀測定波長為490 nm，記錄吸光度(A)值。以生理鹽水培養的細胞為對照，每個濃度設置3個復孔。細胞生長抑制率=(1-A實驗組/A對照)×100%。繪制細胞生長曲線確定貝伐單抗或3-MA的半數抑制劑量(IC50)，用于后續實驗。

1.3 貝伐單抗聯合3-MA對HCT116細胞的影響

1.3.1 實驗分組 取對數生長期的HCT116細胞，調細胞密度為1×108L-1并接種于細胞培養板，分4組處理，分別為對照組(加入生理鹽水)、貝伐單抗組、3-MA組及聯合組,每組3個復孔。

1.3.2 細胞自噬變化的觀察 取對數生長期的HCT116細胞，經胰蛋白酶消化處理后接種于24孔板，待細胞貼壁，按1.3.1分組處理48 h，棄培養液，加入濃度為10 mg/L的吖啶橙(AO)，室溫、避光條件下孵育20 min，冷PBS洗滌3次，最后于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞中酸性自噬泡的變化。

1.3.3 細胞凋亡率檢測 將細胞接種于6孔板，待細胞貼壁，按1.3.1分組處理48 h，離心收集懸浮細胞，使用胰蛋白酶消化并收集細胞，用冷PBS洗滌2次，加入5 μL Annexin V-FITC染色液并混勻，4 ℃避光條件下孵育15 min，隨后加入10 μL PI并輕輕混勻，同等條件下孵育5 min，然后上流式細胞儀檢測。1.3.4 細胞中Beclin-1和Caspase-9蛋白檢測 HCT116細胞同上分組處理48 h后，用Western blot法檢測Beclin-1和Caspase-9蛋白的表達。一抗工作濃度均為1:500，辣根過氧化物酶標記的二抗工作濃度均為1:2 000。以GAPDH為內參照。最后行ECL，掃描拍照，應用Image J圖像處理軟件進行灰度分析。

1.4 統計學處理 應用SPSS 13.0進行分析。采用2×2析因設計的方差分析比較貝伐單抗、3-MA單用及聯用對HCT116細胞凋亡率、Beclin-1和Caspase-9蛋白表達的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 貝伐單抗和3-MA作用濃度的篩選 HCT116細胞生長曲線見圖1。作用于HCT116細胞48 h，貝伐單抗的IC50為16 mg/L，3-MA的IC50為5 mmol/L，因此后續實驗貝伐單抗和3-MA的作用濃度選用16 mg/L和5 mmol/L。

圖1 貝伐單抗(上)和3-MA(下)作用下HCT116細胞的生長曲線

2.2 貝伐單抗聯合3-MA作用后HCT116細胞自噬變化 倒置熒光顯微鏡下(圖2)觀察，對照組細胞胞核呈綠色熒光，胞質可見少量點狀紅色熒光；貝伐單抗組細胞胞核呈黃綠色熒光，且胞質呈點片狀紅色熒光；3-MA組細胞胞核呈綠色熒光，胞質未見紅色熒光；聯合組細胞胞核呈淡綠色熒光，胞質可見稀少紅色熒光。結果提示，對照組、貝伐單抗組存在自噬現象，而3-MA可以抑制貝伐單抗誘導的HCT116細胞自噬。

A:對照組;B:貝伐單抗組;C：3-MA 組；D：聯合組。圖2 細胞自噬表現(AO染色，×400)

2.3 貝伐單抗聯合3-MA作用后HCT116細胞凋亡率檢測結果 見表1。3-MA和貝伐單抗均可誘導HCT116細胞凋亡，且兩者有協同作用。

表1 4組HCT116細胞凋亡率的比較(n=3) %

F3-MA=5 690.925,F貝伐單抗= 525 121.004,F交互=9 674.245，P均<0.001。

2.4 貝伐單抗聯合3-MA作用后HCT116細胞中Beclin-1和Caspase-9蛋白的表達 見圖3，表2、3。3-MA和貝伐單抗單獨作用均可增強HCT116細胞中Caspase-9的表達，且兩者有協同作用。3-MA可降低HCT116細胞中Beclin-1蛋白的表達，貝伐單抗則促其表達，兩者有拮抗作用。

1：對照組；2：3-MA組；3：貝伐單抗組；4：聯合組。圖3 4組細胞中Beclin-1和Caspase-9蛋白的表達

表2 4組細胞Beclin-1蛋白表達的比較(n=3)

F3-MA=1 680.884,F貝伐單抗=8 776.717,F交互=66.749，P均<0.001。

表3 4組細胞Caspase-9蛋白表達的比較(n=3)

F3-MA=1 615.213,F貝伐單抗=5 978.611,F交互=89.905，P均<0.001。

3 討論

大量新生血管的形成是腫瘤的特征之一[6]。貝伐單抗為新型靶向VEGF的人源化單克隆抗體，主要通過中和VEGF，阻斷其與膜上相關受體的結合，從而減少腫瘤細胞的血供、氧供等，抑制腫瘤細胞的生長、轉移[7]。目前貝伐單抗主要應用于晚期結直腸癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的輔助治療，可顯著延長患者的生存期[8-9]。

自噬是細胞一種重要的防御和自我保護機制[10]。在腫瘤早期，自噬通過破壞腫瘤細胞來抑制腫瘤的發生；在腫瘤的增殖期，腫瘤內部會出現血供不良，自噬可以使其對抗缺氧和營養不足。研究[11]表明，應用分子靶向藥物治療惡性腫瘤的同時也可誘導腫瘤細胞發生自噬，從而削弱分子靶向藥物的療效。使用伊馬替尼治療慢性髓系白血病時，伊馬替尼可通過誘導自噬相關基因Beclin-1高表達，從而對白血病細胞起到保護作用，而抑制自噬可促進伊馬替尼誘導的白血病細胞的死亡[12]。曲妥珠單抗在治療HER-2(+)的乳腺癌過程中易發生耐藥，而聯合應用3-MA可增強曲妥珠單抗的治療效果[13]。

該研究中，作者采用3-MA、貝伐單抗單獨或聯合作用于HCT116細胞，觀察HCT116細胞自噬變化，檢測自噬相關蛋白Beclin-1表達的變化，同時檢測細胞凋亡率和凋亡相關蛋白Caspase-9表達的變化。結果顯示，3-MA可增強貝伐單抗誘導的結腸癌HCT116細胞的凋亡，減弱貝伐單抗誘導的HCT116細胞的自噬水平。

該研究結果提示，自噬抑制劑3-MA可增強貝伐單抗的抗腫瘤作用，自噬抑制劑和貝伐單抗聯合應用可成為一種新的結腸癌輔助治療方法。

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(2016-08-31收稿 責任編輯王 曼)

Effect of autophagy inhibition on bevacizumab-induced apoptosis of human colon cancer HCT116 cells

CHAITing,RENShuang,ZHANGYanyan,KUANGJing,YANGJiamei

DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

autophagy;bevacizumab;colon cancer;apoptosis

Aim: To study the effect of autophagy inhibition on bevacizumab-induced apoptosis of HCT116 cells.Methods: Human colon cancer HCT116 cells were treated with bevacizumab and autophagy inhibitor 3-methyl adenine(3-MA) alone or combined for 48 h, cell apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC staining and flow cytometry, the changes of acidic autophagic vacuoles observed by acridine orange staining, the expressions of autophagy-related protein Beclin-1 and apoptosis-related protein Caspase-9 were detected by Western blot. Results: The median inhibition dose of bevacizumab for 48 h was 16 mg/L, and that of 3-MA was 5 mmol/L. At these doses,3-MA alone could decrease the expression of Beclin-1 in the cells(P<0.05), while bevacizumab alone could enhance Beclin-1 expression(P<0.05), and the effects of bevacizumab and 3-MA were antagonistic(P<0.05). 3-MA and bevacizumab alone could increase the apoptosis rate(P<0.05) and enhance the expression of Caspase-9 protein in the cells(P<0.05), and they had synergistic effect(P<0.05).Conclusion: Autophagy inhibition may enhance the killing effect of bevacizumab on the human colon cancer HCT116 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.028

R735.3