Notch信號通路配體Jagged1、Dll4在子癇前期胎盤組織中的表達

趙先蘭，陶 雅，王永紅，劉 傳，杜瑩瑩

鄭州大學第一附屬醫院產科 鄭州 450052

Notch信號通路配體Jagged1、Dll4在子癇前期胎盤組織中的表達

趙先蘭△，陶 雅，王永紅，劉 傳，杜瑩瑩

鄭州大學第一附屬醫院產科 鄭州 450052

△女，1965年10月生，博士，主任醫師，研究方向：高危妊娠，E-mail：ZXL12129@163.com

子癇前期；Notch信號通路；Jagged1；Dll4；胎盤

目的：探討Notch信號通路配體Jagged1、Dll4在子癇前期胎盤組織中的表達及意義。方法：選取輕度子癇前期患者30例(輕度組)、重度子癇前期患者30例(重度組)、正常妊娠孕婦30例(對照組)，采用免疫組化法檢測其胎盤組織中Jagged1、Dll4的定位表達,采用熒光定量PCR技術和Western blot法分別檢測胎盤組織中Jagged1、Dll4 mRNA及蛋白的表達。結果：Jagged1主要表達于血管內皮細胞和絨毛滋養層細胞，Dll4主要表達于血管內皮細胞。輕、重度組胎盤組織中Jagged1、Dll4 mRNA及蛋白的表達水平均低于對照組(P<0.05)，且重度組低于輕度組(P<0.05)；對照組胎盤組織中Jagged1與Dll4在mRNA和蛋白水平上的表達均呈正相關(r=0.806和0.808，P<0.05)，輕度組中兩者表達的相關性減弱(r=0.675和0.560，P<0.05)，而在重度組中未發現兩者的相關性。結論：Jagged1、Dll4在子癇前期胎盤組織中表達失衡，與子癇前期的發病關系密切。

子癇前期是胎盤缺血性疾病[1]，是因母體子宮螺旋動脈重鑄異常、母胎血液灌注不足造成的子宮胎盤血液循環障礙和胎盤功能缺陷。此外，胎盤絨毛數量下降、間質血管形成減少也可使胎盤缺血，導致持續性胎盤缺氧而釋放大量細胞因子進入血液循環，最終引發母體疾病表現[2]。研究[3]發現Notch信號通路在細胞增殖、分化、浸潤、凋亡及血管發生過程中起重要作用，可影響胚胎發育。Jagged1和Dll4分別為Notch信號通路的Serrate樣和Delta樣配體，Dll4被認為是Notch家族4種受體和5種配體中唯一具有內皮特異性的因子[4]。國外研究[5]顯示Jagged1、Dll4均在血管形成中起重要作用，兩者相互拮抗，卻又共同促進血管生成發育，Jagged1促進血管出芽增殖，Dll4則抑制血管出芽而使管腔增粗、功能成熟。有研究[6]發現Jagged1、Dll4在胎盤組織中表達，而關于其在子癇前期中的研究較少，是否與子癇前期胎盤血管生成發育有關尚不可知。該研究探討了Jagged1、Dll4在子癇前期患者胎盤組織中的表達情況，為深入理解子癇前期的發病機制提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年6月至12月在鄭州大學第一附屬醫院產科住院分娩的孕婦90例。其中輕度子癇前期孕婦30例(輕度組)，年齡20～39(29.5±4.6)歲，孕1～3(1.9±0.8)次；重度子癇前期孕婦30例(重度組)，年齡22～44(32.2±5.9)歲,孕1～3(2.0±0.8)次；對照組30例，為無合并癥的正常孕婦，年齡23～36(30.9±3.6)歲，孕1～3(1.9±0.8)次。子癇前期診斷及分類標準參照《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》[7]。3組孕婦年齡、孕次等差異無統計學意義(P>0.05)，均未臨產、未破膜，均為剖宮產術分娩,均無慢性高血壓、先天性心臟病、糖尿病、腎病、甲狀腺功能異常等合并癥及并發癥。

1.2 標本的收集及處理 3組孕婦均于剖宮產時于胎盤母體面中央避開梗死、鈣化區留取約1 cm×1 cm×1 cm組織2塊，一塊經生理鹽水漂洗于4 ℃ 40 g/L多聚甲醛溶液中固定，另一塊置無菌凍存管中于-80 ℃冰箱保存。

1.3 胎盤組織中Jagged1、Dll4的定位 采用免疫組化SP法檢測。固定后的胎盤組織常規石蠟包埋，連續4 μm厚切片，體積分數3%過氧化氫清除內源性過氧化物酶，Jagged1抗人一抗、Dll4抗人一抗均購于Santa Cruz公司，稀釋度均為1:50，嚴格按照SP法說明書進行操作。以PBS代替一抗作陰性對照。采用病理圖像分析系統觀察拍照。

1.4 胎盤組織中Jagged1、Dll4 mRNA表達水平的檢測 應用實時熒光定量PCR法檢測。用Trizol試劑一步法提取胎盤組織總RNA，用微量紫外分光光度計測定RNA純度，反轉錄得cDNA。PCR引物由北京博大泰克公司設計合成，Jagged1上、下游引物序列分別為5’-GCGTCCACGGCATCTGTAAT-3’和5’-GGCTGATGAGTCCCACAGTAATT-3’；Dll4上、下游引物序列分別為5’-CGGGTCATCTGCAGTGACAAC-3’和5’-AGTTGACATCTTGGTCACAAAACAG-3’；GAPDH上、下游引物序列分別為5’-AGCCTCAAGAT CATCAGCA-3’和5’-AGTCCTTCCACGATACCAA-3’。PCR反應體系：cDNA 0.8 μL,2×TransStart Top Green qPCRSuperMix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，去RNase水8.4 μL，總體積20 μL。擴增條件：94 ℃預變性30 s，1個循環；94 ℃5 s，55 ℃15 s，72 ℃10 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算目的mRNA的表達水平。

1.5 胎盤組織中Jagged1、Dll4 蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法檢測。將胎盤組織剪碎后加入預冷的裂解液冰上勻漿裂解1 h，4 ℃ 14 000g離心5 min,吸取上清液，測定蛋白濃度。上樣量50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，分離后轉至硝酸纖維素膜，加入一抗(小鼠抗人Jagged1抗體稀釋度1:1 000，小鼠抗人Dll4抗體稀釋度1:800)4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h；以GAPDH為內參；ECL法顯色。采用Bandscan 5.0軟件進行灰度分析，測定目標蛋白表達水平。

1.6 統計學處理 采用SPSS 21.0進行分析，3組mRNA和蛋白表達水平數據均非正態分布，故以M(P25～P75)表示，表達水平的比較采用Kruskal Wallis檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法，對Jagged1和Dll4表達的相關性進行Pearson相關性分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 胎盤組織中Jagged1、Dll4的定位 免疫組化結果顯示，Jagged1主要表達于胎盤血管內皮細胞和絨毛滋養層細胞，Dll4主要表達于胎盤血管內皮細胞，見圖1。

A：對照組；B：輕度組；C：重度組；1：Jagged1；2：Dll4。圖1 胎盤組織中Jagged1、Dll4的定位表達(SP，×400)

2.2 3組胎盤組織中Jagged1、Dll4 mRNA和蛋白表達水平的比較 見圖2、表1。輕、重度組胎盤組織中Jagged1、Dll4 mRNA和蛋白表達水平均低于對照組，且重度組低于輕度組。

1：對照組；2：輕度組；3：重度組。圖2 3組胎盤組織中Jagged1、Dll4 蛋白的表達

表1 3組胎盤組織中Jagged1、Dll4 mRNA和蛋白表達水平的比較

*：與對照組比較，P<0.05；#：與輕度組比較，P<0.05。

2.3 胎盤組織中Jagged1、Dll4表達的相關性分析

對照組胎盤組織中Jagged1與Dll4在mRNA和蛋白水平上的表達均呈正相關(r分別為0.806和0.808，P<0.001)；輕度組胎盤組織中兩者表達均呈正相關，但相關性減弱(r分別為0.675和0.560，P=0.001)；而重度組胎盤組織中并未發現Jagged1、Dll4 mRNA(r=0.036，P=0.849)及蛋白(r=0.003，P=0.986)表達存在相關性。

3 討論

人類正常胎盤形成過程中，滋養細胞貼附子宮壁，侵入蛻膜間質、子宮肌層，重塑母體小血管，與此同時胎盤絨毛分級、絨毛內血管呈分枝型及非分枝型生長，血管密度增加，功能成熟。子宮螺旋動脈重塑，形成低阻力、高流量血流，使母體血液充分灌注于絨毛間隙；胎盤絨毛內血管網絡構建、功能成熟保證了母胎間的物質交換。

Notch信號通路是一個進化上十分保守的跨膜受體蛋白家族，影響胚胎發育，在細胞增殖、分化、凋亡和血管形成中起重要作用。經典的Notch信號通路又稱CSL依賴途徑，由兩個相鄰細胞的相互作用而激活，鄰近細胞的Notch受體及配體結合，經過兩次水解，釋放出活化的Notch胞內區域(Notch intracellular domain,NICD)，NICD轉移至核內與轉錄因子CSL結合，作用于DNA，調控細胞行為。

該研究發現，Jagged1在正常胎盤組織中高表達，尤其是血管內皮細胞和絨毛滋養層細胞，而Dll4在胎盤血管內皮細胞中高表達；這與Herr等[6]提出的Notch家族蛋白在胎盤組織中表達，可能參與胎盤形成的結論一致。Benedito等[5]發現，位于莖細胞的Jagged1與位于尖端細胞的Dll4在血管形成方面具有相互拮抗作用，還發現Jagged1基因敲除小鼠的視網膜血管出芽數量急劇下降，而上調Jagged1基因表達則內皮細胞密度增大、血管出芽增多。Scehnet等[8]發現，Dll4/Notch信號通路可以抑制血管過度增生，并促進血管成熟，阻斷此信號通路可以增加血管數量。上述研究結果提示Jagged1促進血管出芽、增加血管數量，而Dll4則可以抑制血管的過度生成并促進血管成熟，兩者共同促進血管生成發育。在胎盤血管內皮細胞中檢測到Jagged1及Dll4的表達，說明Notch信號通路可能參與胎盤血管的形成，在胎盤血循環過程中起重要作用。

Cobellis等[9]發現Notch蛋白在子癇前期胎盤組織中的表達低于正常胎盤組織。該研究也發現，子癇前期胎盤組織中Jagged1、Dll4的表達均下降，病情越重，表達水平越低。該研究還觀察到Jagged1、Dll4的表達在正常妊娠胎盤組織中高度相關，而在輕度子癇前期胎盤組織中相關性減弱，重度子癇前期胎盤組織中則未觀察到兩者有相關性。推測在正常的血管生成發育過程中，可能存在Jagged1與Dll4表達的動態平衡：Jagged1促進血管出芽增殖、增加新生血管數量，而Dll4則抑制無功能新生血管的過度增殖，使其增粗、功能成熟，兩者共同促進血管正常生成發育，以保證血液循環系統的有效建立；而Jagged1與Dll4表達失衡、新生血管發育不足則有可能參與了子癇前期的發生[10]。

總之，Jagged1、Dll4與血管生成發育有關，在子癇前期胎盤組織中低表達且表達失衡，導致胎盤血管生成發育不足，胎盤血液循環障礙，母胎間物質交換減少，與子癇前期的發病相關。

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(2016-09-13收稿 責任編輯王 曼)

Expressions of Notch ligand Jagged1 and Dll4 in preeclampsia placental tissue

ZHAOXianlan,TAOYa，WANGYonghong，LIUChuan,DUYingying

DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

preeclampsia;Notch signaling pathway;Jagged1;Dll4;placenta

Aim: To explore the expressions of Notch ligand Jagged1 and Dll4 in preeclampsia placentas. Methods: Placental specimens from 30 normal pregnant women(control group),30 mild preeclampsia women(mild group) and 30 severe preeclampsia women(severe group) were collected to detect the location of Jagged1 and Dll4 protein by immunohisto chemistry; RT-qPCR and Western blot were used to determine the expressions of mRNA and protein of Jagged1 and Dll4, respectively. Results: Jagged1 was mainly expressed in vascular endothelial cells and trophoblast cells.Dll4 was expressed in vascular endothelial cells. The mRNA and protein expressions of Jagged1 and Dll4 in placentas from patients of mild group and severe group were significantly lower than those from control group(P<0.05), which was lowest in severe group(P<0.05). The mRNA and protein expressions of Jagged1 were positively correlated with those of Dll4 in control group(r=0.806,0.808，P<0.05), and weakened in mild group(r=0.675,0.560，P<0.05), but had no correlation in severe group. Conclusion: The imbalance of Jagged1 and Dll4 may be related to the occurrence of preeclampsia.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.029

R714.24