正常宮頸上皮細胞原代培養體系的改良*

李 雅，榮守華，智艷芳，樊婷婷，邱 翠，李肖甫

鄭州大學第三附屬醫院細胞室 鄭州 450052

正常宮頸上皮細胞原代培養體系的改良*

李 雅，榮守華，智艷芳，樊婷婷，邱 翠，李肖甫#

鄭州大學第三附屬醫院細胞室 鄭州 450052

#通信作者，男，1964 年7 月生，碩士，教授，研究方向：腫瘤細胞病理學，E-mail：lixiaofu1964@163.com

原代培養；宮頸上皮細胞；中性蛋白酶；角質細胞無血清培養基

目的：探索一種高效、可重復的正常宮頸上皮細胞原代培養方法。方法：取60例正常宮頸組織，分成2組，分別采用Ⅱ型中性蛋白酶聯合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA(中性蛋白酶聯合法)及Ⅰ型膠原酶消化分離后進行原代培養，比較兩種分離效果；觀察采用中性蛋白酶聯合法消化不同時間對分離效果的影響。觀察添加體積分數5%FBS dK-SFM培養基與單純dK-SFM培養基培養原代宮頸上皮細胞的生長曲線差異，并用形態學、廣譜角蛋白免疫細胞化學染色鑒定細胞來源。結果：正常宮頸上皮細胞原代培養總成功率為40%。中性蛋白酶聯合法成功率、分離所得細胞密度、原代細胞融合時間及細胞純度均高于Ⅰ型膠原酶消化法(P<0.05)。中性蛋白酶消化20 h的分離效果優于消化16和24 h(P<0.05)。體積分數5%FBS dK-SFM培養基原代培養的宮頸上皮細胞增殖活性高于單純dK-SFM培養基(P<0.05)。細胞生長狀況良好，可在體外傳代至5～6代，并可凍存與復蘇，免疫細胞化學染色顯示廣譜角蛋白表達陽性。結論：Ⅱ型中性蛋白酶聯合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分離法和體積分數5% FBS dK-SFM培養基培養原代正常宮頸上皮細胞，高效、可重復性好。

剛離體的原代細胞保留有原有的生物學遺傳特性，能反映體內細胞生長的一般特征，適用于藥物及癌癥治療等研究[1-2]。正常宮頸上皮細胞原代培養對于深入研究人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)在宮頸癌發生發展中的作用機制至關重要。從理論及實際操作的角度而言，建立正常宮頸上皮細胞及攜帶HPV的宮頸上皮細胞的體外細胞模型，有利于更好地了解HPV 感染宮頸上皮細胞的病理改變，而且較體內動物實驗更為簡便易行。但原代細胞獲得過程較復雜、細胞純度低且培養困難，限制了宮頸原代細胞的應用。雖然目前已有少量對正常宮頸上皮細胞原代培養的研究[3-5]，但一直尚無公認且成熟穩定的正常宮頸上皮細胞原代培養方法。因此，該研究通過比較不同分離方法、不同培養基對正常宮頸上皮細胞原代培養的影響，旨在探尋一種最佳的正常宮頸上皮細胞原代培養方法，為宮頸癌發病機制的研究打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型中性蛋白酶購于美國Sigma公司，無血清角質細胞培養基dK-SFM購于美國Gibco公司，DMEM/F12培養基購于美國Hyclone公司，0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA、D-PBS、Ⅰ型鼠尾膠原均購于北京索萊寶科技有限公司，鼠抗人廣譜細胞角蛋白單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，兔抗人波形蛋白多克隆抗體、即用型免疫組織化學試劑盒購于上海生工生物工程有限公司，CCK-8購于日本同仁公司，無菌細胞爬片購于無錫耐思生物科技有限公司。CO2培養箱為美國Thermo公司產品，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司產品)。1.2 正常宮頸上皮組織來源 選取2015年9月至2016年4月在鄭州大學第三附屬醫院婦科因良性子宮病變(如子宮肌瘤、子宮腺肌病等)行子宮全切術患者的宮頸標本60例，患者年齡43～54歲，中位年齡47歲；術前液基細胞學及HPV檢測結果均為陰性，且術后追蹤組織學結果提示無宮頸異常病變。所有患者均簽署知情同意書。無菌條件下術中子宮離體后立即取宮頸鱗柱交界區上皮組織2～3塊，每塊大小約1 cm×1 cm×1 cm，置于含10 mL提前預冷的DMEM-F12轉移培養基的離心管中，轉移至含雙抗(青、鏈霉素)的培養基內，20 min內4℃低溫轉運。1.3 實驗分組 分為2組，每組30例，分別采用中性蛋白酶聯合法及Ⅰ型膠原酶法進行分離及原代培養。

1.4 正常宮頸上皮細胞的體外分離

1.4.1 宮頸上皮細胞的分離 將標本轉移至含雙抗預冷D-PBS溶液的培養皿中，剪去血污及結締組織，浸泡5 min，并用預冷D-PBS溶液沖洗5次。①中性蛋白酶聯合法：將標本平均分為3份，加入5 mL(2.4 U/mL)Ⅱ型中性蛋白酶溶液并轉移至15 mL離心管中，4 ℃ 過夜消化，分別消化16、20和24 h后，室溫下于超凈工作臺靜置1 h，用眼科彎鑷沿一個方向完整分離整塊上皮組織，再次用含雙抗的D-PBS溶液沖洗3次，用眼科剪將其剪碎，加入0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA 5 mL，轉移至15 mL離心管，37 ℃消化10 min后，加入體積分數10%完全基礎培養基終止消化，吹打離散2 min，靜置2 min。②Ⅰ型膠原酶法：用眼科剪將組織剪碎至糊狀，加入Ⅰ型膠原酶(0.2 g/mL)溶液5 mL并轉移至15 mL離心管，37 ℃消化50 min，待組織邊緣模糊、酶消化液變稍渾濁，加入體積分數10%完全基礎培養基稀釋終止消化。吸取上清液，用200目濾網過濾至15 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，用5 mL的dK-SFM培養基重懸細胞。

1.4.2 原代培養及傳代培養 原代培養：調整細胞懸液濃度為3×105mL-1，接種于Ⅰ型鼠尾膠原(2 μg/cm2)預包被的25 cm2培養瓶，置于體積分數5% CO2、37 ℃培養箱進行原代培養。48 h后首次換液，之后每2 d更換新鮮培養液。若細胞背景干凈，可每2 d給予半換液，細胞對數生長期除外。倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀況及細胞融合時間。 傳代培養：當細胞生長至70%～80%融合，PBS沖洗，加入1 mL 0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA，室溫下放置0.5 min，吸棄胰酶，置于37 ℃培養箱3 min，倒置相差顯微鏡下觀察細胞逐漸變亮、變圓，并出現流沙樣運動時，立即加入完全培養基終止消化，將單細胞懸液分為兩等份，1 500 r/min分別離心5 min，棄上清液，進行傳代培養。實驗分為兩組，一組為原代和傳代培養均添加體積分數5%FBS的dK-SFM組，另一組為原代和傳代培養均采用的單純dK-SFM組。

1.5 細胞計數 倒置相差顯微鏡下用細胞計數板計數所得的細胞密度及中性蛋白酶聯合法消化不同時間所得的細胞數量。實驗重復3次。

1.6 細胞活力的測定 將細胞懸液與0.4 g/mL臺盼藍以體積比9:1混勻，3 min內在倒置相差顯微鏡下計數活細胞與死細胞，死細胞被染成藍色，活細胞呈透明狀，不著色。細胞活力=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。實驗重復3次。

1.7 正常宮頸上皮細胞的免疫細胞化學鑒定 選取廣譜細胞角蛋白抗體為上皮細胞鑒定標志物，間質細胞標志物波形蛋白抗體為陰性對照，將細胞接種于同樣預包被的6孔培養板中，調整細胞密度為(1～2)×105mL-1，生長約3 d細胞融合至70%～80%，用40 g/L多聚甲醛常溫固定 20 min后，加入廣譜細胞角蛋白抗體和波形蛋白抗體，4 ℃過夜孵育，按二抗試劑盒操作說明加入二抗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。以胞質呈棕黃色為陽性染色細胞。倒置相差顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)，計數陽性細胞和同一視野下細胞總數。正常宮頸上皮細胞的純度/(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%，實驗重復3次。

1.8 CCK-8法繪制細胞生長曲線 取第2代對數生長期添加體積分數5%FBS dK-SFM培養基和單純dK-SFM培養基的細胞。常規0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA消化，調整細胞密度至1×104mL-1，將細胞懸液接種于96孔板，100 μL/孔，每組設5個復孔。細胞貼壁后第1天開始，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃繼續孵育2 h，檢測450 nm處吸光度(OD)值。實驗重復3次，繪制第1～7天細胞生長曲線。

1.9 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析。兩種分離方法分離的細胞密度、原代細胞融合時間的比較采用兩獨立樣本t檢驗，成功率的比較采用χ2檢驗，細胞純度的比較采用Fisher精確概率法。中性蛋白酶聯合法不同消化時間的分離細胞密度、細胞活力、原代細胞融合時間、原代所獲細胞數量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonfrroni檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞的原代培養情況 共收集標本60例，培養成功24例(總培養成功率為40%)。其中中性蛋白酶聯合法培養成功16例，Ⅰ型膠原酶法培養成功8例。

2.2 兩種分離方法對細胞原代培養效果的影響 中性蛋白酶聯合法成功率、分離所得細胞密度、原代細胞融合時間及細胞純度均高，見表1。中性蛋白酶聯合消化法分離所得細胞數量明顯多于Ⅰ型膠原酶法，見圖1。

表1 不同方法分離效果的比較

#：精確概率法。

A:Ⅰ型膠原酶消化法；B:中性蛋白酶聯合法。圖1 兩種方法分離所得的原代正常宮頸上皮細胞(×200)

2.3 中性蛋白酶聯合法不同消化時間對培養效果的影響 中性蛋白酶聯合法在消化20 h時所得細胞密度、細胞活力、原代細胞融合時間及原代所獲細胞量均高于消化16和24 h，見表2。

表2 中性蛋白酶聯合法不同消化時間培養效果的比較

*:與培養16和24 h比較，P<0.05。

2.4 細胞原代和傳代培養的形態學觀察 經中性蛋白酶聯合消化分離、采用體積分數5% FBS dK-SFM培養基培養48 h，可見細胞大部分貼壁伸展，呈多角形或圓形，成團聚集分布，胞核明顯，少量成纖維細胞呈紡錘形，圍繞上皮細胞呈旋渦狀或放射狀排列。細胞從第5天開始增殖速度明顯加快，生長至大約第12天細胞融合可達70%～80%，細胞之間緊密相連，胞核清晰，呈典型鋪路石樣形態，見圖2A。

傳代細胞于24 h即可貼壁伸展，第3～4代細胞形態略大小不等，呈多角形或圓形，胞體飽滿，胞質豐富，胞核清晰，可見明顯核仁，增殖速度較快，第7～8天細胞融合可達70%～80%，見圖2B。第5～6代細胞形態大小不等，胞體增大，胞質顆粒增多，胞核較大，空泡化明顯，增殖速度較前減慢，約8～10 d細胞融合達70%左右，見圖2C。正常宮頸上皮細胞在體外可傳至5～6代，最終衰老從瓶底脫落。原代培養的正常宮頸細胞可進行凍存及復蘇，細胞復蘇后可保持正常形態，見圖2D，且可繼續傳1～2代。

A：原代正常宮頸上皮細胞體外培養12 d；B：第2次傳代的正常宮頸上皮細胞體外培養7 d; C：第4次傳代的正常宮頸上皮細胞體外培養9 d；D：正常凍存宮頸上皮細胞復蘇后7 d。圖2 正常宮頸上皮細胞培養的形態學特征(×200)

2.5 宮頸上皮細胞的免疫細胞化學鑒定結果 培養的原代細胞95%以上角蛋白染色陽性表達，見圖3。

A：抗廣譜角蛋白抗體染色；B：抗波形蛋白抗體染色。圖3 原代正常宮頸上皮細胞免疫細胞學鑒定結果(×400)

2.6 兩種培養基培養的第2代細胞生長曲線 體積分數5% FBS dK-SFM培養基培養的細胞增殖活性高于單獨dK-SFM培養基，見圖4。

A:體積分數5%FBS dK-SFM培養基;B:dK-SFM培養基。圖4 兩種培養基培養的第2代細胞生長曲線

3 討論

既往研究[6]報道，單獨采用0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分離法和單獨采用Ⅰ型膠原酶37 ℃消化40 min均能成功對正常宮頸上皮細胞進行原代培養，但分離的細胞純度及細胞量不令人滿意。作者也嘗試單獨采用0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA在不同的消化時間進行消化分離，但所得宮頸上皮細胞密度低、活性差且不易貼壁，究其原因可能與胰蛋白酶可降解細胞表面的蛋白質，容易消化過度造成細胞損傷有關。中性蛋白酶消化不破壞表皮間的細胞連接，可完整地將上皮層從結締組織分離，保留基底層，從而減少具有增殖能力細胞的損傷[7]。所以該研究采用Ⅱ型中性蛋白酶聯合胰蛋白酶進行消化分離，發現中性蛋白酶聯合法與單獨Ⅰ型膠原酶消化法相比，可完整分離上皮組織，消化所得上皮細胞純度較高，且隨上皮細胞的增長，纖維細胞逐漸減少，無需進行特殊純化。中性蛋白酶聯合法分離成功率、所得細胞密度、原代細胞融合時間及細胞純度均高于單獨使用Ⅰ型膠原酶。曾有學者[8-10]報道，采用Ⅱ型中性蛋白酶聯合0.25 g/mL胰蛋白酶和0.01%Ⅰ型膠原酶的分離方法，但缺乏原代培養方法的具體消化時間點及具體步驟。作者對中性蛋白酶過夜消化的時間進行反復摸索，最終選擇16、20和24 h 3個時間點，分別對其消化效果進行比較分析，結果表明中性蛋白酶消化20 h所得的細胞數量、細胞活力最佳，細胞達融合的時間最短。

報道[11]稱用3T3照射過的小鼠成纖維細胞與上皮細胞共培養，其提供的生長因子可促進上皮細胞的生長。后來，有研究[12]發明了無3T3照射細胞，含牛垂體浸膏且專用于宮頸上皮細胞培養的MCDB153培養基，直至目前進一步改良的無血清KSFM培養基。KSFM培養基因無血清成分，可有效抑制成纖維細胞的生長，其添加的表皮生長因子(EGF)、牛腦垂體提取物(BPE)等能夠特異地促進上皮細胞貼壁與生長，已廣泛應用于各種類型上皮細胞的原代培養[13-15]。但是血清中所含有的某些營養成分又是人工無血清培養基無法替代的。因此，該研究選擇體積分數5%FBS dK-SFM培養基與單獨dK-SFM培養基進行比較，結果顯示前者細胞貼壁和增殖活性優于單獨dK-SFM，且不至于導致纖維細胞的過度增長，與Liu等[6]的報道相似。且作者在細胞貼壁后采用含體積分數5%FBS的dK-SFM進行原代及傳代培養，經免疫細胞化學鑒定角蛋白表達陽性，證明培養的細胞為上皮細胞來源，并可判斷培養細胞的純度。采用此方法培養的原代細胞，第3～4代細胞形態最佳，增殖速度最快，而第5～6代的細胞逐漸老化、增殖緩慢，因此，建議采用第3～4代細胞進行實驗。

由于宮頸在體內處于半開放環境，而患者術前常伴有陰道細菌、真菌感染或者陰道出血病史，且原代培養操作步驟繁多，均大大增加了宮頸細胞原代培養污染的概率。該研究在培養期間出現過污染現象，推測很可能與高壓后的器械未及時烘干，導致器具污染、試劑污染或組織本身污染等有關。

總之，采用Ⅱ型中性蛋白酶聯合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分離細胞和體積分數5%FBS dK-SFM培養基培養的原代正常宮頸上皮細胞生長狀況最佳，可在體外增殖及傳至5～6代。

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(2016-09-23收稿 責任編輯李沛寰)

An improved culture system for the primary culture of normal cervical epithelial cells

LIYa，RONGShouhua，ZHIYanfang，FANTingting，QIUCui，LIXiaofu

DepartmentofCytopathology，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

primary culture;cervical epithelial cell;dispase;dK-SFM

Aim: To explore an effective and repeatable method for the primary culture of normal cervical epithelial cells. Methods: A total of 60 normal human ectocervical tissue were collected and divided into two groups, primarily cultured using combined type Ⅱdispase and 0.25 g/mL trypsin-EDTA digestion method and type Ⅰ collagenase digestion method separately, and to compare the effectiveness of isolation, furthermore, to observe the detached effectiveness of combined dispase digestion method after digestion for different time. Cervical epithelial cells were cultured in 5% FBS dK-SFM and dK-SFM alone, respectively, to observe the growth of the primary cervical cells. The cultured cells were identified by the morphological analysis and pancytokeratin was identified by immunocytochemistry.Results: The total success rate of the primary culture in this study was 40%. The success rate, density, primary cell fusion time and purity of cells of the dispase digestion group were all higher than those of collagenase digestion group(P<0.05). The dispase digestion for 20 h was more effective than digestion for 16 and 24 h(P<0.05). The cell growth curve showed that the cells cultured in 5% FBS dK-SFM grew better and had a higher viability than cells cultured in dK-SFM alone(P<0.05). The primary cultured cells grew well and could be subcultured for five to six generations,and they also could be cryopreserved and resuscitated. Pancytokeratin positive staining was determined by immunocytochemistry. Conclusion: It is an effective and repeatable method for primary culture of normal cervical epithelial cells by using combined type Ⅱ dispase and 0.25 g/mL trypsin-EDTA digestion and 5% FBS dK-SFM medium.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.032

*河南省醫學科技攻關計劃資助項目 201503112

R711.74