核磁共振氫譜法測定甘露聚糖肽中多糖的含量

吳夢琪，張文清，徐志珍，宛燕飛，張 力，夏 瑋*

(1.華東理工大學 上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237；2.成都利爾藥業有限公司，四川 成都 610083)

核磁共振氫譜法測定甘露聚糖肽中多糖的含量

吳夢琪1，張文清1，徐志珍1，宛燕飛2，張 力2，夏 瑋1*

(1.華東理工大學 上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237；2.成都利爾藥業有限公司，四川 成都 610083)

以甘露聚糖肽為研究對象，首次采用1H-NMR法測定多糖產品中的多糖含量。以基準試劑鄰苯二甲酸氫鉀為內標，考察了弛豫延遲時間和采樣次數對測定結果的影響。選定核磁共振參數弛豫延遲時間1 s，采樣次數16次。考察結果表明，該方法具有很好的重復性和精密度。在對甘露聚糖肽定性鑒定的基礎上，采用絕對定量方式測定了甘露聚糖肽實際樣品的多糖含量，結果與苯酚-硫酸法一致。該方法專屬性高，操作方便，結果準確，不僅可用于甘露聚糖肽中多糖含量的測定，還可用于其它結構明確的多糖含量測定。

核磁共振氫譜；多糖含量；甘露聚糖肽

甘露聚糖肽是我國首創的一種新型免疫促進劑，是將從健康人咽喉部分離的α-溶血性鏈球菌33號菌株經發酵、提取、精制而獲得的一種糖肽類物質[1]。目前，甘露聚糖肽質量標準中的多糖含量采用傳統的苯酚-硫酸法[2]進行測定，但該方法由于使用強腐蝕性酸，其危險系數高，操作較復雜，人為操作及測量誤差不可避免，重現性差，且專屬性不強。

核磁共振波譜是有機物定性的有力工具，由于1H-NMR中的共振峰面積與該共振峰所對應的質子數成正比，使得該方法可用于定量分析[3-4]。高強度磁場和傅立葉變換技術的應用使儀器性能得到較大改善，其測定準確度、重現性和靈敏度能滿足定量要求，目前很多國家和地區已將NMR技術用于藥物的定量分析和檢測[5-7]，2010年中國藥典新增了核磁共振波譜定量方法[8]。但是核磁共振波譜法用于多糖含量的測定至今未見報道。本文以甘露聚糖肽為研究對象，考察了NMR實驗條件對測定結果的影響，建立了測定甘露聚糖肽中多糖含量的1H-NMR方法，并與傳統方法的結果進行比較。實驗結果為甘露聚糖肽質量標準的提高提供了科學依據，并為其他種類糖肽或多糖產品的多糖含量測定提供了參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DD2400-MR型核磁共振儀(安捷倫科技有限公司)；Mettler AE240型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；Pipetman P100 100-1000 μL型微量移液槍(吉爾森公司)；甘露聚糖肽供試品(批號：131101，131102，G100102，成都利爾藥業有限公司)；鄰苯二甲酸氫鉀(純度>99.05%，國藥集團上海化學試劑有限公司)；重水(氘代度：99.8%，北京希凱創新科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取干燥的甘露聚糖肽供試品60 mg和內標物鄰苯二甲酸氫鉀10 mg，置于塑料離心管中，準確加入1.0 mL重水，超聲至樣品完全溶解，轉移至5 mm核磁管中，待測。

1.2.2 核磁測定條件1H-NMR的共振頻率為400 MHz，采樣參數如下：脈沖序列(seqfil)：s2pul，掃描次數(ct)：16，空掃次數(ss)：0，譜寬(sw):8 012.8 Hz，脈沖角度(pw)：30，接收增益(gain)：10，測試溫度(temp)：30 ℃，弛豫延遲時間(d1)：1.0 s，窗函數線寬因子(lb)：0 Hz。

1.2.3 甘露聚糖肽的定性鑒定 在優化條件下，測定添加內標物的甘露聚糖肽的1H-NMR譜，將異頭氫區域譜圖峰形和峰位移值與甘露聚糖肽標準品進行比對，采用相關系數法測定譜圖相似度，采用Microsoft EXCEL軟件分析所選定光譜區的數據，將供試品譜圖的Y軸坐標與對照品圖譜的Y軸坐標進行比較，計算相關系數ρ，若相關系數ρ>0.95，認為二者糖鏈結構一致；反之，則糖鏈結構不一致[9]。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 內標物的選擇 核磁定量要求內標物具有化學性質穩定、不與溶劑和樣品發生反應、純度高、易稱量以及信號峰不干擾樣品測定等特質。核磁定量常用的內標物有：1,2,4,5-四氯苯、1,4-二硝基苯、對苯二酚、對苯二酸、鄰苯二甲酸氫鉀和苯甲酸芐酯等。由于甘露聚糖肽樣品易溶于水，且鄰苯二甲酸氫鉀的化學位移在7.56～7.74之間，與甘露聚糖肽樣品的信號完全分離，故實驗采用易溶于水的鄰苯二甲酸氫鉀作為內標。

圖1 添加內標物的甘露聚糖肽樣品的1H-NMR譜圖Fig.1 1H-NMR spectrum of mannatide adding internal standard

2.1.2 定量峰的選擇 由于內標物的定量峰須與被測樣品的信號峰完全分離，或者至少保證有一組峰完全分離，以保證積分結果的準確性。本實驗選擇鄰苯二甲酸氫鉀為內標，甘露聚糖肽供試品的1H-NMR譜圖見圖1。可觀察到鄰苯二甲酸氫鉀的兩組質子峰分別為：H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)和H-3,6(δ7.72～δ7.74,2H,dd)。本實驗選擇其中一組質子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內標物的定量峰。甘露聚糖肽樣品的信號集中在3.20～5.80之間，主要分為兩個區域：①異頭氫區，5.80～4.40；②環質子區，4.40～3.20。其中，異頭氫區的信號(4.88～5.35)不與其他氫信號重疊，且異頭氫譜峰的化學位移值、峰形與甘露聚糖肽糖鏈結構重復單元中不同連接方式的糖殘基一一對應，因此，本實驗選擇整個異頭氫區域的譜峰(4.88～5.35)作為定量峰。

2.1.3 樣品及內標物濃度的選擇 待測樣品和內標物的濃度要考慮樣品的溶解性，并且需將樣品和內標物的強度信號控制在具有可比性的范圍內。如果待測樣品和內標物之間的濃度差過大，會造成核磁信號的溢出，導致信號失真，手動積分時，最高信號面積的微小變化會引起顯著的量化誤差；而如果樣品濃度過低，會導致積分結果誤差偏大。本實驗選擇樣品濃度為60 mg/mL，鄰苯二甲酸氫鉀濃度為10 mg/mL，此時樣品的溶解性和流動性均較好，且從圖1也可以看出，樣品及內標物信號在可比范圍內。

2.1.4 弛豫延遲時間的選擇 以內標物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內標定量峰，設定其積分面積(Ar1)為2.000，考察了不同弛豫延遲時間(1，2，5，10，25 s)下，鄰苯二甲酸氫鉀的質子峰H-3,6(δ7.72～δ7.74,2H,dd)的積分面積(Ar2)。實驗結果顯示，隨著弛豫延遲時間的增加，Ar2分別為2.003，2.005，2.009，2.015，2.025，其值略微增加，但各條件下Ar2值均接近其實際質子數，重現性較好，為節省時間，選擇弛豫延遲時間為1 s。

2.1.5 掃描次數的選擇 以內標物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內標定量峰，設定其積分面積為2.000，考察了掃描次數(2，4，8，16，32次)對甘露聚糖肽異頭氫區域(δ4.88～δ5.35)譜峰積分面積(As)的影響。結果顯示，采樣次數較少時，重現性較差，當掃描16次以上時，As的數據重現性較好，繼續增大掃描次數，As無明顯提高，因此實驗選擇掃描16次。

2.2 甘露聚糖肽多糖含量的測定

2.2.1 定量公式的推導 根據1H-NMR中譜峰面積與該譜峰對應氫原子數成正比的原理，可知溶液中所有氫的吸收強度均相等，即Ar/MHr=As/MHs。式中，Ar為內標定量峰的積分面積；MHr為內標定量峰包含氫原子的摩爾數；As為供試品定量峰的積分面積；MHs為供試品定量峰包含氫原子的摩爾數[10]。等式左邊內標物的計算比較簡單直觀，只需將稱量的內標物質量Wr、內標定量峰包含氫原子的數目Nr以及內標物相對分子質量Mr代入，將左邊算式變成Ar·Mr/(Nr·Wr)。等式右邊反映的是甘露聚糖肽所有糖殘基異頭氫的情況，樣品定量峰面積As以整個異頭氫區域譜峰面積來表示。通過上述等式可得到樣品中所有糖殘基異頭氫的摩爾數MHs。由于甘露聚糖肽的糖鏈部分由甘露糖和少量葡萄糖組成，甘露糖和葡萄糖均為六碳糖，相對分子質量均為180.155。樣品中多糖的質量可用甘露糖和葡萄糖的總質量表示，多糖的質量Ws等于MHs·Ms，Ms值為180.155。進一步根據甘露聚糖肽樣品的質量W，可以得到樣品中多糖含量Ws%。

2.2.2 精密度試驗 在優化條件下，取同一供試品溶液，連續測定6次，以內標物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內標定量峰，設定其積分面積為2.000，記錄樣品定量峰的積分面積(As)并計算相對標準偏差(RSD)。結果顯示6次測定結果的RSD 為0.34%，表明該方法精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 在優化條件下，平行制備3份供試品(批號131101)溶液，以內標物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內標定量峰，設定其積分面積為2.000，記錄樣品定量峰積分面積(As)并計算供試品中多糖含量的RSD值。3份樣品含量測定值的RSD 為0.71%，說明該方法重復性良好。

2.2.4 對不同批次樣品的測定結果 采用核磁共振氫譜法對不同批次的甘露聚糖肽原料藥樣品進行測定，結果如表1所示，多糖含量分別為101%，100%，99.6%。說明該方法測定甘露聚糖肽原料藥樣品中的多糖含量可行且測定結果穩定。

表1 不同批次樣品的測定結果Table 1 The measurement results of different batches of samples

同時采用苯酚-硫酸法對批號131101的原料進行測定，測得多糖含量為104%，兩種方法的測定結果相一致。需要說明的是，為了提高該測定方法的專屬性，應先采用核磁共振氫譜法進行定性鑒定，計算樣品和甘露聚糖肽標準品的相似度，如果相關系數ρ>0.95，認為二者糖鏈結構一致,可進一步采用核磁共振氫譜法進行含量測定,否則由于樣品中含有其他糖類物質或在異頭氫區域有吸收的雜質,將會導致測定結果不能準確反映甘露聚糖肽的真實含量。另外核磁共振波譜法不僅局限于測定甘露聚糖肽的含量，其他多糖的含量如果結構明確也可以采用該方法進行測定。

3 結 論

本文建立了1H-NMR測定甘露聚糖肽中多糖含量的方法，所建立的方法專屬性強，精密度高，重現性好，準確度高，且操作簡便，可用于測定甘露聚糖肽的多糖含量。此外，該方法還可用于其它結構明確的多糖含量測定。

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Determination of Polysaccharide Content in Mannatide by1H-NMR

WU Meng-qi1,ZHANG Wen-qing1,XU Zhi-zhen1,WAN Yan-fei2,ZHANG Li2,XIA Wei1*

(1.Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China；2.Chengdu Lier Pharmaceutical Co.,Ltd.,Chengdu 610083,China)

A proton-nuclear magnetic resonance(1H-NMR) method was established for the determination of polysaccharide content in mannatide using potassium acid phthalate as the internal standard.Effects of some experiment parameters were investigated.The optimal conditions were selected as follows:relaxation delay time(d1):1 s；transient number(ns):16.The results indicated that,under the optimal conditions,the good precision and repeatability for the method were obtained.The polysaccharide content in mannatide, determined by the1H-NMR method with inner standard model,was similar to that of the ultraviolet spectrophotometry method.The established method was simple,specific and repeatable.Therefore,it could be used not only for the determination of polysaccharide content in mannatide,but also for detection of other kinds of polysaccharide with definite structures.

1H nuclear magnetic resonance；polysaccharide content；mannatide

2016-10-07；

2016-11-22

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.021

O482.532；O629.12

A

1004-4957(2017)05-0693-04

*通訊作者：夏 瑋，博士，副教授，研究方向：天然產物的研究與應用，Tel：021-64253221，E-mail：xiawei1999@ecust.edu.cn