響應面法優化纖維素酶提取柚葉多酚工藝及其抗氧化研究

陳建福

（漳州職業技術學院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000）

響應面法優化纖維素酶提取柚葉多酚工藝及其抗氧化研究

陳建福

（漳州職業技術學院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000）

采用纖維素酶輔助對柚葉中的多酚進行提取，在單因素實驗基礎上，通過響應面法對影響柚葉多酚提取的工藝條件進行優化，建立了酶解時間、酶用量、pH、酶解溫度四因子與多酚提取率的二次多項式模型，并考察了其抗氧化性能。結果表明，纖維酶輔助提取柚葉多酚的最佳工藝條件為：酶解時間80 min，酶用量200 U、pH5.8、酶解溫度49℃。在此條件下柚葉多酚的提取率為35.90 mg·g-1，與預測值相比，其相對誤差為0.582%，驗證了回歸方程的有效性，說明響應面模型可以較好地預測柚葉多酚的提取率，該工藝與無酶預處理的超聲輔助提取工藝相比，提取率提高了23.20%，柚葉多酚對羥自由基有一定的清除能力，并能與維生素C起協同作用。

柚葉；多酚；纖維素酶；響應面，抗氧化

柚子，又名文旦、內紫等，是蕓香科植物柚的成熟水果，在我國福建、廣東、廣西、湖南等14個省區均有分布[1-2]。柚子營養豐富，具有豐富的有機酸、蛋白質及其他一些人體所需要的微量元素，越來越受到了人們的歡迎[3-4]。漳州是琯溪蜜柚的主產地，隨著蜜柚產量的增加，每年由于蜜柚摘取后剩下的柚葉也在逐年增加，柚葉中含有大量的多酚類等天然有效成分，因此常具有抗衰老、抗炎、抗菌、凈化空氣等功效[5-6]，被用來制作成沐浴露、塔香、洗發水、洗手液、隔離防護霜，然而由于加工技術的落后，在果農摘完琯溪蜜柚后，沒有對柚葉深加工，造成了極大的浪費。

本實驗在超聲波輔助提取柚葉多酚的基礎上，用纖維素酶對柚葉進行預處理，使纖維素酶分解柚葉細胞壁上的纖維素，促進細胞內部的多酚類物質更大容量地溶出，考察纖維素酶預處理對柚葉多酚提取率的影響；并通過響應面法對影響柚葉多酚纖維素酶預處理的工藝流程進行優化，研究其對羥基自由基的清除作用，為柚葉多酚的綜合利用提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

數顯鼓風干燥箱GZX-9070MBE，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；冷凍干燥機LGJ10-C，北京四環科學儀器廠；電子天平BSA124S，賽多利斯科學儀器有限公司；超聲波清洗機SCQ-3201E，上海聲彥超聲波有限公司；紫外可見分光光度計UV-1800PC-DS2，上海美譜達儀器有限公司；高速多功能粉碎機Q-250B，上海冰都電器有限公司。

柚葉，采于漳州市平和縣的琯溪蜜柚；纖維素酶（10000 U·g-1），食品級，天津市諾奧科技發展有限公司；食用酒精（乙醇），食品醫藥級，河南浩宇食品添加劑有限公司；硫酸鋰，分析純，西隴化工股份有限公司；鎢酸鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸，分析純，天津市瑞金物化學品有限公司，鉬酸鈉，分析純，天津市化學試劑四廠；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 多酚含量的測定

采用福林-酚法[7]，配制0.1 mg·mL-1的沒食子酸標準溶液，分別準確移取一定濃度梯度（0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2 mL）的沒食子酸標準溶液加入到10 mL容量瓶中，再分別加入6 mL的蒸餾水與0.5 mL的福林-酚試劑，搖勻，1 min后再分別加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，定容，并置于75℃水浴中10 min，冷卻，于765 nm處測定吸光度，繪制曲線，并進行回歸，得回歸方程。用上述方法進行測定并代入回歸方程計算得到

其中：b為柚葉多酚質量濃度/mg·mL-1；V為提取液定容后的體積/mL；m為柚葉質量/g。

1.2.2 超聲波輔助提取方法

將采摘的柚葉用清水浸泡洗凈，再用蒸餾水淋洗，晾干，并用冷凍干燥機進行干燥，粉碎，過篩備用。提取時，稱取一定量的柚葉粉末，裝入100 mL燒瓶中，置于超聲波清洗器中，在設定的操作條件下進行提取，提取結束后，過濾去渣，稀釋，定容，按1.2.1中的方法計算柚葉多酚的提取率。通過響應面方法對超聲波輔助提取柚葉多酚的工藝進行了優化，得到了最佳工藝條件為：超聲溫度63℃、超聲功率245 W、液料比25 mL·g-1、超聲時間28min、乙醇濃度60%，柚葉多酚提取率為29.14 mg·g-1，并以此超聲輔助提取柚葉多酚的最佳工藝條件作為柚葉酶處理后的提取工藝。

1.2.3 纖維素輔助提取柚葉多酚

利用纖維素酶對柚葉進行預處理，預處理完后，在最佳的超聲工藝條件下，對柚葉多酚進行提取，并計算得到柚葉多酚的提取率，酶解工藝如下：

1.2.3.1 酶解時間對多酚提取率的影響

固定酶用量200 U、pH5.5、酶解溫度50℃的條件下，考察不同酶解時間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min）對柚葉多酚提取率的影響。

1.2.3.2 酶用量對多酚提取率的影響

在固定酶解時間80 min、pH 5.5、酶解溫度50℃的條件下，考察不同酶用量（50 U、100 U、150 U、200 U、250 U、300 U）對多酚提取率的影響。

1.2.3.3 pH對多酚提取率的影響

固定酶解時間80 min、酶用量200 U、酶解溫度50℃的條件下，考察不同pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 、6.5）對多酚提取率的影響。

1.2.3.4 酶解溫度對多酚提取率的影響

固定酶解時間80 min、酶用量200 U、pH 5.5的條件下，考察不同酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）對多酚提取率的影響。

1.2.4 抗氧化能力研究

利用對羥自由基的清除能力來評價多酚的抗氧化能力，羥自由的清除能力按文獻[8]方法所示。

1.3 響應面的因素與水平設計

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken實驗設計原理，選取酶解時間（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）四因素為自變量，柚葉多酚提取率為響應值，設計四因素三水平實驗，因素與水平見表1。

表1 因素與水平表

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對多酚提取率的影響

從圖1中可以看出，當酶解時間在20～80 min時，隨著酶解時間的延長，多酚提取率不斷增大，當酶解時間超過80 min時，多酚提取率又開始下降。這是因為隨著酶解時間的延長，酶的作用時間長，酶活力得到充分體現，酶解反應進行越來越徹底，多酚提取率增加，而當酶解時間過長時，酶解作用效果不再明顯，多酚提取率甚至開始下降[9]，因此，最佳的酶解時間選擇為80 min。

圖1 酶解時間對多酚提取率的影響

2.1.2 酶用量對多酚提取率的影響

圖2 酶用量對多酚提取率的影響

從圖2中可以看出，當酶用量的在50～200 U時，隨著酶用量的增加，多酚提取率不斷增大，當酶用量超過200 U時，多酚提取率又開始下降。這是因為隨著酶用量的增加，纖維素酶與柚葉顆粒的作用點越來越多，增加了酶解速率，提高了多酚的溶出，當酶用量過大時，過多的酶會堆積而包裹住柚葉顆粒，阻礙多酚的傳質[10]。因此，最佳的酶用量選擇為200 U。

2.1.3 pH對多酚提取率的影響

從圖3中可以看出，當pH在4.0～5.5時，隨著pH的上升，多酚提取率不斷增加，當pH超過5.5時，多酚提取率又開始下降。這是因為pH較低時，酸性太強會影響纖維素酶的構象，從而影響酶的活力，而當pH過大時，酸性較低，破壞了酶空間結構中的共價健作用，而使酶變性，導致多酚提取率下降[11]，因此，最佳的pH選擇為5.5。

圖3 pH對多酚提取率的影響

2.1.4 酶解溫度對多酚提取率的影響

從圖4中可以看出，當酶解溫度在40～50℃時，隨著酶解溫度的升高，多酚提取率不斷增加，當酶解溫度超過50℃時，多酚提取率又開始下降，這是因為酶解溫度較低時，酶促反應較慢，隨著酶解溫度的升高，酶的反應速率增加，增加了纖維素酶與柚葉顆粒細胞壁的作用頻率，多酚提取率增大，而當酶解溫度過高時，酶活力減弱，甚至會發生酶失活而喪失催能力，使得多酚提取率的下降[12]，因此，最佳的酶解溫度選擇為50℃。

圖4 酶解溫度對多酚提取率的影響

2.2 響應面法優化柚葉多酚提取工藝

2.2.1 響應面分析及結果

根據Box-Benhnken實驗設計，以柚葉多酚提取率（Y）為響應值，酶解時間（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）為自變量，通過，Design-Expert 8.05b軟件進行響應面分析，實驗結果和方差分析如表2、表3所示。

表2 響應面方案及結果

表3 方差分析

利用Design-Expert 8.05b統計軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到柚葉多酚提取率（Y）與酶解時間（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）的二次多項回歸方程：

由表3可知，該回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項不顯著（P=0.1753＞0.05），相關系數R2= 0.9147，說明有超過91%的數據可用利用該模型進行分析，方程擬合較好；一次項A、B，交互項AB、AC、BC、BD、CD對柚葉多酚提取率影響不顯著（P＞0.05）；一次項C、D，交互項AD，二次項A2、B2、C2、D2對柚葉多酚提取率影響極顯著（P＜0.01）；根據F值及P值均可判斷，各因素對柚葉多酚提取率影響作用順序為：pH＞酶解溫度＞酶用量＞酶解時間。

2.2.2 因素間的相互作用分析

圖5 酶解各因素交互作用對多酚提取率的影響

圖5 是纖維素酶對柚葉預處理過程的各工藝條件對柚葉多酚提取率的響應面圖。圖中描述的是所考察的四個工藝條件中任意兩個因素為零水平時，另兩個工藝條件的交互作用對柚葉多酚提取率的影響。從圖5中可以看出，酶解時間和酶解溫度的響應面曲線較陡，說明酶用量和酶解時間的交互作用對柚葉多酚的提取率影響最為顯著，酶解時間和pH的響應面曲線相對較陡，說明酶解時間和pH的交互作用對柚葉多酚的影響顯著性次之，而pH和酶解溫度的響應面曲線最為平緩，說明pH和酶解溫度的交互作用對柚葉多酚的影響最不顯著。綜合以上分析可得，影響纖維素酶輔助提取柚葉多酚提取率的主次因素順序為pH＞酶解溫度＞酶用量＞酶解時間。

2.2.3 最佳提取條件的確定及驗證

通過回歸方程進行預測得到纖維素酶輔助提取柚葉多酚的最佳條件為：酶解時間80.03 min，酶用量201.29 U、pH 5.76、酶解溫度49.38℃，在此最佳條件下，回歸方程預測的最大柚葉多酚提取率為36.11 mg·g-1。為實際操作的便利性，將預測的最佳工藝條件修正為：酶解時間80 min，酶用量200 U、pH 5.8、酶解溫度49℃。在此最佳條件下對柚葉多酚進行提取，提取3次進行驗證實驗，柚葉多酚的平均提取率為35.90 mg·g-1，與預測值相比，其相對誤差為0.582%，驗證了回歸方程的有效性，說明利用響應面法對纖維素酶輔助提取柚葉多酚的工藝進行優化是可靠的，具有一定的應用價值，且該工藝與沒有進行酶預處理的超聲波輔助工藝相比[13]，提取率提高了23.20%，為柚葉多酚的開發與利用提供新的依據。

2.3 柚葉多酚的抗氧化能力

羥基自由基是引發各種疾病的一種強活性自由基，以柚葉多酚對羥自由基的清除率來考察其抗氧化性能，如圖6所示。從圖6中可以看出，柚葉多酚和維生素C對羥基自由基均有一定的清除能力，并隨著柚葉多酚和維生素C濃度的增加而增大，在相同濃度下，維生素C對羥自由基的清除率能力要強于柚葉多酚。但當柚葉多酚與維生素C混合時（質量1∶1混合），在一定濃度時，柚葉多酚會與維生素C產生協同作用，而使得其混合物具有較高的羥基自由基清除能力。

圖6 柚葉多酚和維生素C對·OH的清除能力

3 結論

以柚葉為原料，采用纖維素酶對柚葉中的多酚進行輔助提取，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法對影響柚葉多酚提取的工藝條件進行優化，建立了二次多項式方程，并確定了最佳工藝條件為：酶解時間80 min，酶用量200 U，pH 5.8，酶解溫度49℃。在最佳工藝條件下，柚葉多酚的提取率為35.90 mg·g-1，與預測值相比，其相對誤差為0.582%，驗證了回歸方程的有效性，說明利用響應面法對纖維素酶輔助提取柚葉多酚的工藝進行優化是可靠的，具有一定的應用價值，且該工藝與沒有進行酶預處理的超聲波輔助工藝相比，提取率提高了23.20%，柚葉多酚對羥基自由基有一定的清除能力，并能夠與維生素C產生協同作用，為柚葉多酚抗氧劑的開發與利用提供新的依據。

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Optimization of Cellulose-assisted Extraction of Polyphenols from Pomelo Leaves Using Response Surface Methodology and its Antioxidant Activities

CHEN Jiɑnfu

（School of Food and Biological Engineering，Zhangzhou Institute of Technology，Zhangzhou Fujian 363000，China）

Polyphenols were extracted from pomelo leaves by cellulose-assisted extraction.Based on the single-factor experiment，the involving factors was optimized by using response surface analysis and a quadratic polynomial regression equation was established for the yield of polyphenols as function of enzymolysis time，enzyme amount，pH and enzymolysis temperature and antioxidant activities were examined.The results showed that the optimal extraction conditions of polyphenols from pomelo leaves were：enzymolysis time 80 min，enzyme amount 200U，pH 5.8，enzymolysis temperature 49℃.The yield of total flavonoids could be up to 35.90 mg·g-1under the optimal extraction condition，the relative error was 0.582%compared to the predictive value，which indicated the feasible model fitted well with the experimental data.Results showed that the response surface model could be used to predict the extraction yield of polyphenol from pomelo leaves.The extraction yield increased by 23.20%compared to ultrasonic assisted extraction technology with no enzyme pretreatment and it had good free radicals scavenging activity and synergy with vitamin C.

Pomelo Leaves；Polyphenols；Cellulose；Response Surface Methodology；Antioxidant Activities

Q55；S38

A

1009-8666（2017）04-0011-07

10.16069/j.cnki.51-1610/g4.2017.04.003

［責任編輯、校對：李書華］

2017-01-03

福建省高校杰出青年科研人才培育計劃（閩教科[2015]54號）；福建省中青年教師教育科研項目計劃“柚葉多酚的分離及性能研究”（JA15688）

陳建福（1982—），男，福建南安人。漳州職業技術學院講師，博士，研究方向：天然產物化學工藝。