美洲大蠊、斑蝥提取物對(duì)3株人腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的研究

閆爽??高孟婷 鄭園園 郭娜娜 陳俊雅++耿玲 肖懷 李玥

【摘要】目的：研究從昆蟲美洲大蠊和斑蝥中提取的3個(gè)活性部位YS-I、YS-II、YS-III對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、人食管癌細(xì)胞Eca-109和人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用。方法：將從昆蟲美洲大蠊、斑蝥中提取的3個(gè)活性部位分別作用于MGC-803、Eca-109、HepG2細(xì)胞株，采用MTT法檢測(cè)受試物作用24、48、72小時(shí)后細(xì)胞增殖抑制情況，計(jì)算IC50值，并研究其量效、時(shí)效關(guān)系。結(jié)果：3個(gè)由昆蟲中提取的活性部位對(duì)人源MGC-803、Eca-109、HepG2腫瘤細(xì)胞株均有一定的增殖抑制作用，并呈現(xiàn)較好的時(shí)間依賴和劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：美洲大蠊提取物YS-I及斑蝥不同極性提取物YS-II、YS-III對(duì)人胃癌、食管癌、肝癌細(xì)胞具有較好的增殖抑制作用，為今后進(jìn)一步研發(fā)昆蟲源低毒、高效的抗腫瘤藥物奠定了一定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 昆蟲；美洲大蠊；斑蝥；增殖抑制；抗腫瘤

【中圖分類號(hào)】R2827407【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）10-0033-05

Proliferation Inhibition of Extracts from Reriplaneta amerlcana and Mylabris on Three Human Tumor Cells

YAN Shuang1，2GAO Meng ting1，2ZHENG Yuanyuan1，2

GUO Nana1，2CHEN Junya2GEN Ling2XIAO Huai1，2，3，4LI Yue1，2，3，4*

1Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Dali 671000， China；

2College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali 671000， China；

3Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics， Dali 671000， China；

4National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics， Dali 671000， China

Abstract： Objective To study the proliferation inhibition on MGC-803 cell、Eca-109 cell and HepG2 cell with three active extracts（YS-I， YS-II， YS-III）from Periplaneta americana and Mylabris Methods To incubate MGC-803、Eca-109 and HepG2 cell with three active extracts from Periplaneta americanaand Mylabrisfor 24，48 and 72 hours， cell proliferation in different concentration and time was determined by MTT assay Calculating IC50 values and study its dose，time-effect relationship Results Three active extracts frominsects have a certain proliferation inhibition on MGC-803 cell， Eca-109 cell and HepG2 cell The inhibition effect had good time-dependent and dose-dependent Conclusion Three active extracts from Periplaneta americanaand Mylabrishave a good proliferation inhibition on MGC-803， Eca-109 and HepG2 cell Laying a foundation for further research and development of low toxicity， efficient insect anti-tumor drugs.

Keywords： Insects； Periplaneta americana； Mylabris； Proliferation Inhibition；Antitumor

惡性腫瘤對(duì)人類生命健康危害極大，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2014年世界癌癥報(bào)告》提及未來20年每年新發(fā)癌癥病例將達(dá)到2200萬(wàn)，同期癌癥死亡數(shù)將上升至1300萬(wàn)例[1]。據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心報(bào)道，2015年中國(guó)有4292萬(wàn)例癌癥新發(fā)病例，2814萬(wàn)例死亡病例，其中肺癌、胃癌、食管癌和肝癌居于前列[2]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)腫瘤的治療方式主要是手術(shù)、藥物及放射治療等。癌癥中、晚期，化療和放療為主要的治療手段，但化療和放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往伴隨著嚴(yán)重的毒副作用，對(duì)正常細(xì)胞也有一定影響，使患者承受著身體和精神上的巨大痛苦[3]。

動(dòng)物源類中藥資源豐富，在我國(guó)疾病治療中的應(yīng)用有著悠久的歷史。近年研究發(fā)現(xiàn)多種藥用動(dòng)物中提取的活性成分在體外或體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞、荷瘤小鼠腫瘤具有一定的抑制作用[4-6]，且副作用小、相對(duì)安全，提示天然動(dòng)物源抗癌藥物具有較好的開發(fā)前景。藥用斑蝥多為芫菁科昆蟲南方大斑蝥（Mylabris phalerata Pallas）或黃黑小斑蝥 （Mylabris cichorii Linnaeus）的干燥體，臨床研究表明，斑蝥提取物在治療尖銳濕疣、斑禿、風(fēng)濕、肝炎等疑難雜癥時(shí)效果明顯，近年來藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示斑蝥素及其衍生物對(duì)喉癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞有顯著療效[7-9]。美洲大蠊（Periplaneta americana），俗稱“蟑螂”，屬昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬，現(xiàn)代藥理學(xué)及臨床研究顯示其具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、增強(qiáng)肌體免疫力等作用[10-12]，大理大學(xué)藥化學(xué)院工作者致力于藥用昆蟲研發(fā)近30年，何正春等[13-15]將美洲大蠊醇提取物通過聚酰胺柱層析分離劃段得到不同部位，采用MTT法檢測(cè)所得部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖毒性，結(jié)果表明美洲大蠊提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性且毒副作用較小，這些研究為開發(fā)低毒、高效的動(dòng)物類抗腫瘤藥物打下一定基礎(chǔ)。

基于團(tuán)隊(duì)前期的研究基礎(chǔ)，筆者對(duì)大量昆蟲來源的提取物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性篩選，對(duì)于活性明顯的樣品，再次進(jìn)行復(fù)篩及量效、時(shí)效考察。現(xiàn)將來源于美洲大蠊及斑蝥的3個(gè)活性樣品對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、人食管癌細(xì)胞Eca-109、和人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)抑制活性及其量效、時(shí)效關(guān)系報(bào)道如下。

1材料與儀器

11受試樣品美洲大蠊提取物活性部位（YS-I）、斑蝥提取物活性部位（YS-II、YS-III）由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院制備提供。其中YS-I由美洲大蠊乙醇提取物經(jīng)聚酰胺柱分離，40%乙醇/水部分濃縮、冷凍干燥獲得[16]；YS-II為干燥斑蝥蟲體粉末用等極性溶劑提取濃縮物，YS-III為干燥斑蝥蟲體粉末用低極性溶劑提取濃縮物；具體制備方法因涉保密內(nèi)容暫不公開。

12試劑RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco）；DMEM培養(yǎng)液（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；025 %胰蛋白酶-EDTA消化液（密理博公司）；噻唑藍(lán)（MTT）及二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；青霉素、硫酸鏈霉素（Amersco，美國(guó)）；順鉑（DDP，齊魯制藥有限公司）。

13主要儀器SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；3111型水套式CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）；CKX41SF型倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；SN255939型酶標(biāo)儀（BIO-TEK，美國(guó)）；XK96-3微量振蕩器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；BSA124S型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器（上海東亞壓力容器制造有限公司）。

14細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株（MGC-803）、人食管癌細(xì)胞株（Eca-109）、人肝癌細(xì)胞株（HepG2）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

2方法

21實(shí)驗(yàn)原理MTT法是一種快速、簡(jiǎn)便的體外抗腫瘤藥物敏感性測(cè)試方法，目前已被廣泛用于抗腫瘤藥物體外活性篩選實(shí)驗(yàn)。它是利用活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶可將黃色的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide ]（噻唑藍(lán)，MTT）還原為藍(lán)紫色的甲臜（Formazan），甲臜不溶于水，可溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），通過酶標(biāo)儀測(cè)定其在570nm處的光密度（Optical Delnsity，OD）值可推測(cè)活細(xì)胞數(shù)目，了解受試樣品對(duì)細(xì)胞增殖的作用效果。

22受試樣品溶液及陽(yáng)性對(duì)照品溶液的配制樣品溶液配制：稱取一定量活性樣品凍干粉或浸膏，用少量DMSO溶解配制成100mg/mL的儲(chǔ)備液，于4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)液將濃度分別稀釋為300、100、50、30、10、3μg/mL。陽(yáng)性對(duì)照品溶液配制：稱取一定量DDP凍干粉，配制成10mg/mL的儲(chǔ)備液，于4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)液將濃度分別稀釋為5、05、005μg/mL。

23細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞株在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，約每2～3日傳代1次。MGC-803、Eca-109細(xì)胞株均在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，約每2～4天傳代1次。

24細(xì)胞毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、MGC-803、Eca-109細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×105/mL的懸液，接種于96孔板，每孔100μL，于37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔分別加入受試樣品溶液100μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（DDP）、陰性對(duì)照（等量不含藥物的培養(yǎng)液）和空白對(duì)照（只有等量培養(yǎng)基、沒有細(xì)胞），以上于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，棄去上清液，每孔加入20μL，5mg/mL的MTT溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，然后每孔加入150μL的DMSO，于微量振蕩器上振蕩至甲臜完全溶解，在酶標(biāo)儀上于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

25統(tǒng)計(jì)學(xué)處理按以下公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率（%）：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（OD陰性— OD樣品）/（OD陰性 — OD空白）×100%；以藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)繪制量效曲線，并分別用SPSS170的Logistic回歸模型計(jì)算不同作用時(shí)間后的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3結(jié)果

31樣品對(duì)所選腫瘤細(xì)胞的增殖影響效果3個(gè)活性樣品YS-I、YS-II、YS-III及陽(yáng)性藥DDP對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人食管癌細(xì)胞株Eca-109、人肝癌細(xì)胞株HepG2的IC50值，詳見表1。

32樣品對(duì)所選細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)效、量效關(guān)系分析3個(gè)活性樣品YS-I、YS-II、YS-III及陽(yáng)性藥DDP對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人食管癌細(xì)胞株Eca-109、人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖抑制作用的時(shí)效、量效關(guān)系分析結(jié)果見圖1、2、3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示3個(gè)昆蟲類活性樣品YS-I、YS-II、YS-III對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人食管癌細(xì)胞株Eca-109、人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖均具有一定的抑制作用；通過量效和時(shí)效關(guān)系分析表明，3個(gè)樣品對(duì)所選三株細(xì)胞的增殖抑制存在一定的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。其中YS-I對(duì)MGC-803細(xì)胞株在處理24h、48h、72h的IC50值分別為1007、973、647μg/mL，已接近陽(yáng)性藥DDP IC50值的1/2至1/3，具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用；對(duì)另兩株細(xì)胞株Eca-109和HepG2，作用72小時(shí)后的IC50值也小于20μg/mL，提示YS-I對(duì)三株人腫瘤細(xì)胞、尤其是胃癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用。

4討論

蔣永新等[17]研究表明“康復(fù)新液”（主要成分為美洲大蠊提取物）有抑制MGC-823腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，梁剛等[18]研究表明美洲大蠊提取物有抑制人肝癌細(xì)胞Bel- 7402裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的作用。YS-I是美洲大蠊聚酰胺有效部位，對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖均具有較好抑制作用，而人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人肝癌細(xì)胞株HepG2分別與MGC-823、Bel- 7402細(xì)胞株為同源細(xì)胞，推測(cè)YS-I抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）相關(guān)。YS-I尚為多成分混合物，故從其中純化出具有研究和開發(fā)前景的高效抗腫瘤成分值得引起重視。YS-II、YS-III均為斑蝥的有機(jī)溶劑提取部位，在配制樣品溶液時(shí)，會(huì)有少量樣品析出，這可能會(huì)對(duì)斑蝥素抑制腫瘤細(xì)胞的效果有一定影響。本研究顯示，昆蟲來源提取物對(duì)人腫瘤細(xì)胞確實(shí)存在明顯的抑制（或殺滅）作用，具有對(duì)其進(jìn)行深入研究的科研及臨床應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2017-03-22編輯：陶希睿）