應用iTRAQ技術篩選先天性心臟畸形胎兒母親血清差異表達蛋白

陳驪珠，馬巍，張墨，袁正偉

（中國醫科大學附屬盛京醫院1.超聲科；2.國家衛生和計劃生育委員會小兒先天畸形重點實驗室；3.泌尿外科，沈陽110004）

應用iTRAQ技術篩選先天性心臟畸形胎兒母親血清差異表達蛋白

陳驪珠1，馬巍2，張墨3，袁正偉2

（中國醫科大學附屬盛京醫院1.超聲科；2.國家衛生和計劃生育委員會小兒先天畸形重點實驗室；3.泌尿外科，沈陽110004）

目的篩選先天性心臟畸形（CHD）母體血清差異表達蛋白質，明確和CHD相關的候選標志物。方法收集40例CHD胎兒（實驗組）母親血清和10例正常胎兒（對照組）母親血清，其中實驗組包括法洛氏四聯征10例，室間隔缺損10例，共同動脈干10例，其他少見先天性心臟畸形10例。每組10例標本等體積混合后，應用同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ）對蛋白質進行鑒定和相對定量。結果孕婦外周血血清中共鑒定到蛋白質606個，實驗組與對照組差異達到1.5倍以上的蛋白質47個，其中23個在實驗組中上調，24個在實驗組中下調。結論基于iTRAQ技術的蛋白質組學方法能鑒定出多種CHD相關的差異蛋白，CHD發生是一個多種蛋白質分子參與的結果。

同位素標記相對和絕對定量技術；先天性心臟畸形；蛋白質組學；血清標志物；產前診斷

先天性心臟畸形（congenital heart defect，CHD）是最常見的先天畸形之一，30%～50%的新生兒死亡都是由CHD造成的［1］。我國每年有10萬～15萬CHD患兒出生，CHD是新生兒時期的主要死亡原因之一，對患兒及其親屬乃至整個社會都造成沉重的負擔。因此，CHD的早期診斷以及發生機制的研究對于開展CHD的預防或產前干預具有十分重要的意義。目前CHD的產前診斷主要依賴于產前超聲檢查［2］，然而胎兒超聲心動圖僅在一些產前診斷中心得以開展，只有少部分高危妊娠孕婦能夠得到檢查，并且診斷準確率受操作者主觀診斷能力影響較大。因此，急需研究一種能夠早期診斷CHD的分子標志物。

以蛋白質組學為基礎，在孕婦的血清、羊水以及代謝產物中篩選出妊娠相關分子標志物方面的研究取得了顯著進展［3］，妊娠早期在孕婦外周血中應用特異標志物進行特定疾病的診斷成為可能。目前，蛋白質組學技術在產前主要應用于染色體異常胎兒標志物的篩查［4-6］，對胎兒結構畸形產前標志物篩查的研究甚少。隨著蛋白質組學技術的不斷發展，各種各樣蛋白質組學技術應運而生。其中，同位素標記相對和絕對定量技術（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是一種新型的蛋白質組學定量研究技術，可以同時對8種不同來源的樣本進行絕對和相對定量，鑒于其具有高通量、定量效果好、重復性高，標記效率高達97%等優勢，目前廣泛應用于腫瘤標志物及產前診斷標志物的篩查研究［7-9］。KOLLA等［10］應用iTRAQ技術分析了唐氏綜合征胎兒與正常胎兒孕婦血清蛋白表達差異，發現了包括β-HCG（目前臨床上唐氏綜合征產前篩查的標志物之一）在內的多個蛋白表達上調，這也證實了iTRAQ技術在產前標志物篩查應用的可行性。本研究應用iTRAQ技術結合串聯質譜技術比較CHD孕婦與正常孕婦外周血中的蛋白表達差異，篩選孕婦血清中CHD相關標志物，并對這些蛋白標志物進行生物信息學分析，揭示其在CHD胚胎發育過程中可能的作用與價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及分組

選取2011年9月至2014年12月中國醫科大學附屬盛京醫院產前診斷中心40例診斷為胎兒單純CHD孕婦外周血血清（CHD組），其中胎兒法洛氏四聯征（tetralogy of Fallot，TOF）10例，室間隔缺損（ventricular septal defects，VSD）10例，共同動脈干（persistent truncus arteriosus，PTA）10例，其他少見先天性心臟畸形（mix of other rare CHD，MIX）10例（單心室、左心發育不良、心內膜墊缺損、主動脈瓣狹窄、心臟橫紋肌瘤各2例）。選取10例周齡、孕婦年齡與CHD組相匹配的正常孕婦志愿者外周血血清（正常對照組）為對照。

所有孕婦均為單胎妊娠（不包含輔助生殖技術妊娠），孕22～26周，既往身體健康狀況良好，不合并妊娠高血壓、糖尿病、免疫系統疾病，孕期無特殊藥物服用。于清晨空腹抽取靜脈血5 mL，4℃靜置1 h，3 000 r/min離心10 min后取上清，-80℃保存。本研究獲得本單位倫理委員會批準，孕婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質提取與高豐度蛋白去除：將每組10管樣本等體積混合，用Proteo miner試劑盒去除血清高豐度蛋白，并采用Brandford方法進行蛋白定量。

1.2.2 iTRAQ標記：每個樣品取蛋白100 μg，利用胰蛋白酶進行消化，然后按照說明書進行iTRAQ標記。TOF，標記113標簽；VSD，標記114標簽；PTA，標記116標簽；MIX，標記117標簽；正常對照組，標記119標簽。

1.2.3 強陽離子交換器（strong cation exchanger，SCX）分離：采用島津LC-20AB液相系統、分離柱為4.6×250 mm型號的Ultremex SCX柱對樣品進行液相分離，經篩選得到20個組分。每個組分分別用StrataX除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干。同樣方法技術重復2次。

1.2.4 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析：與質譜儀相結合的液相系統為nanoACQuity，包括Symmetry C18柱（規格5 μm，180 μm×20 mm）和BEH130 C18柱（規格1.7 μm，100 μm×100 mm）兩部分。所用的流動相A液（水∶乙腈∶甲酸=98∶2∶0.1）和B液（水∶乙腈∶甲酸=2∶98∶0.1）中都加入一定比例的校正液（Thermo Fisher Scientific）。每次上樣量為2.25 μg（9 μL），用A液以2 μL/min的流速進行洗脫15 min。然后用含5%B液的流動相以300 nL/min流速洗脫1 min，建立洗脫梯度。40 min內B液梯度線型從5%升至35%，再5 min從35%升至80%，然后80%持續洗脫5 min，最后2 min恢復柱料。同樣方法技術重復2次。

使用的機器為TripleTOF 5600（AB SCIEX，Concord，ON），離子源為NanosprayⅢsource（AB SCIEX，Concord，ON），放射器為石英材料拉制的噴針（New Objectives，Woburn，MA）。數據采集時，機器的參數設置如下：離子源噴霧電壓2.5 kV，氮氣壓力為30 psi（14.5 psi≈1 bar），噴霧氣壓15 psi，噴霧接口處溫度150℃；掃描模式為反射模式，分辨率≥30 000；積累250 ms的從2+到5+的離子挑選其中強度每秒積累超過120分的前30個進行掃描，3.3 s為1個循環；第2個四極桿（Q2）的傳輸窗口設置為100 Da為100%；脈沖射頻電的頻率為11 kHz；檢測器的檢測頻率為40 GHz；每次掃描的粒子信號以4個通道分別記錄共4次后合并轉化成數據；對于iTRAQ類項目，離子碎裂的能量設置為（35±5）eV；母離子動態排除設置為：在50%的出峰時間內（約18 s），相同母離子的碎裂不超過2次。

1.3 生物信息學分析

使用數據庫搜索軟件將處理后得到的數據通過Mascot檢索軟件（MASCOT T2.3.02）檢索。通過檢索Gene Ontology數據庫和COG數據庫，對鑒定出的所有蛋白進行GO功能注釋和COG功能分析。

2 結果

2.1 鑒定得到差異蛋白

利用Mascot軟件中的Scaffold算法對同位素峰面積計算，搜索數據庫后完成對蛋白質的相對定量和鑒定。最終在孕婦外周血血清中鑒定到二級譜圖2 816 076個，匹配到特有肽段的譜圖數量12 050個，鑒定到特有肽段序列2 549個，相應得到蛋白質606個。606個蛋白質中差異倍數達到1.5倍以上的蛋白47個，其中23個在CHD組中上調，24個在CHD組中下調，差異蛋白信息見表1。這47種差異蛋白質，部分在4組亞型CHD中均差異表達，部分在一組或幾組不同亞型CHD中差異表達（圖1）。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 GO注釋：按照功能進行分類差異蛋白主要涉及到細胞進程（16.67%）、應激反應（12.96%）、單有機體過程（12.96%）、代謝過程（9.26%）、生物功能調節（5.56%）、發育過程（5.56%）、信號轉導（3.7%）等，提示了孕婦血清里蛋白含量的復雜性。見圖2。

2.2.2 COG注釋：經過COG注釋分析，發現差異蛋白所占比例最大的為細胞骨架蛋白，所占比例達到26.67%，見圖3。

3 討論

CHD作為最常見的出生缺陷，其診斷與發生機制的研究一直是國內外學者普遍關注的。然而，在產前，CHD的診斷主要依靠超聲心動圖檢查［2］，鑒于超聲心動圖對操作者技術要求較高，而且診斷時間較晚，在臨床應用過程中受到一定限制。

圖1 差異蛋白表達交集圖Fig.1 Venn diagram of the differentially expressed serum proteins

在孕婦的外周血中篩選出畸形相關標志物目前公認為是產前診斷的最理想方式。妊娠過程依賴于細胞內和細胞間一系列復雜的相互作用，這包括激素、黏附分子、生長因子以及免疫調節因子等。妊娠期間需要這些因子嚴密地保持復雜的平衡關系。當胎兒發育或妊娠過程出現異常時，這些物質在母體循環中的平衡可能會被打破，此時，相關標志物的確定將有助于疾病的發生及其嚴重程度的判斷［11］。利用孕婦的外周血篩查畸形相關標志物是一種相對無創的產前診斷方法，它可以避免傳統的有創產前診斷方法（羊水穿刺、臍血穿刺等）帶來的風險，并且可以作為一種篩查手段在基層醫院得以開展，而且這種檢查手段有可能早期發現胎兒發育異常，這為早期臨床決策、機制研究以及靶向治療提供了重要依據。

近年來，蛋白質組學技術的不斷進步使產前無創診斷逐漸成為可能。蛋白質組學通過對疾病狀態下全蛋白表達水平變化的定性定量分析，鑒定與疾病特征及病理過程相關的蛋白質、進而發現新的可用于診斷、預后、治療反應監測和靶向治療的生物標志物。目前國內外將蛋白質組學技術應用于產前診斷的研究主要集中于對非整倍體畸形［4-6］、先兆子癇［12］的產前診斷，尚沒有應用蛋白質組學技術對CHD產前診斷標志物篩查的報道。本研究成功應用iTRAQ技術在正常孕婦與CHD胎兒孕婦外周血中鑒定到606種蛋白質，其中47種蛋白質在兩組間存在明顯差異。在下調的24種差異蛋白中，26.67%是細胞骨架蛋白，包括LMNA、TPM4、VIM、TLN1、MYH9、ACTG1、KRT9和FLNA。這些結構蛋白是胚胎發育所必需的，在細胞間物質轉運過程中發揮了重要作用，而且已有文獻報道LMNA［13］、TPM4［14］、MYH9［15］和FLNA［16］幾種蛋白質與某些心臟疾病發生或胎兒發育過程相關。上調的23種蛋白質主要參與脂類代謝、應激反應、免疫反應等生物過程。這與之前的研究［17］認為孕婦本身脂類代謝異常會使胎兒發生CHD的概率升高相符合。其中，5種差異蛋白（TPM4、APOC1、SAA2、SAA4、PF4V1）在4組亞型CHD中均差異表達，提示這些蛋白很有可能參與了多種CHD的發生，而其他42種蛋白在一組或幾組不同亞型CHD中差異表達，也體現了在不同亞型CHD的發生中存在不同分子機制的參與。

表1 經iTRAQ技術鑒定得到的差異蛋白質Tab.1 Differentially expressed proteins identified by using iTRAQ analysis

圖2 GO分類圖（參與生物學功能）Fig.2 GO annotation based on their biological functions

圖3 COG分類圖Fig.3 COG annotation

本研究成功利用蛋白質組學技術和多種生物信息學技術對CHD胎兒孕婦血清的差異蛋白進行了鑒定和生物學功能分析，結果表明CHD的發生過程中有多種蛋白質參與，而這些蛋白質在CHD發生中的具體機制需要進一步研究確定。

［1］CHAMSI-PASHA MA，CHAMSI-PASHA H.Critical congenital heart disease screening［J］.Avicenna J Med，2016，6（3）：65-68. DOI：10.4103/2231-0770.184062.

［2］DONOFRIO MT，MOON-GRADY AJ，HORNBERGER LK，et al. Diagnosis and treatment of fetal cardiac disease：a scientific statement from the American Heart Association［J］.Circulation，2014，129（21）：2183-2242.DOI：10.1161/01.cir.0000437597.44550.5d.

［3］CHOOLANI M，NARASIMHAN K，KOLLA V，et al.Proteomic technologies for prenatal diagnostics：advances and challenges ahead［J］.Expert Rev Proteomics，2009，6（1）：87-101.DOI：10.1586/ 14789450.6.1.87.

［4］KANG Y，DONG X，ZHOU Q，et al.Identification of novel candidate maternal serum protein markers for down syndrome by integrated proteomic and bioinformatic analysis［J］.Prenat Diagn，2012，32（3）：284-292.DOI：10.1002/pd.3829.

［5］HEYWOOD WE，MADGETT TE，WANG D，et al.2D DIGE analysis of maternal plasma for potential biomarkers of down syndrome［J］. ProteomeSci，2011，19（9）：56.DOI：10.1186/1477-5956-9-56.

［6］NARASIMHAN K，LIN SL，TONG T，et al.Maternal serum proteinprofile and immune response protein subunits as markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21，18，and 13［J］.Prenat Diagn，2013，33（3）：223-231.DOI：10.1002/pd.4047.

［7］BOICHENKO AP，GOVORUKHINA N，KLIP HG，et al.A panel of regulated proteins in serum from patients with cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer［J］.J Proteome Res，2014，13（11）：4995-5007.DOI：10.1021/pr500601w.

［8］REHMAN I，EVANS CA，GLEN A，et al.iTRAQ identification of candidate serum biomarkers associated with metastatic progression of human prostate cancer［J］.PLoS One，2012，7（2）：e30885.DOI：10.1371/journal.pone.0030885.

［9］MARZINKE MA，CHOI CH，CHEN L，et al.Proteomic analysis of temporally stimulated ovarian cancer cells for biomarker discovery［J］.Mol Cell Proteomics，2013，12（2）：356-368.DOI：10.1074/ mcp.M112.019521.

［10］KOLLA V，JEN? P，MOES S，et al.Quantitative proteomics analysis of maternal plasma in down syndrome pregnancies using isobaric tagging reagent（iTRAQ）［J］.J Biomed Biotechnol，2010，2010：52047.DOI：10.1155/2010/952047.

［11］KLEIN J，BUFFIN-MEYER B，MULLEN W，et al.Clinical proteomics in obstetrics and neonatology［J］.Expert Rev Proteomics，2014，11（1）：75-89.DOI：10.1586/14789450.2014.872564.

［12］BLANKLEY RT，FISHER C，WESTWOOD M，et al.A label-free selected reaction monitoring workflow identifies a subset of pregnancy specific glycoproteins as potential predictive markers of early-onset pre-eclampsia［J］.Mol Cell Proteomics，2013，12（11）：3148-3159.DOI：10.1074/mcp.M112.026872.

［13］RENOU L，STORA S，YAOU RB，et al.Heart-hand syndrome of Slovenian type：a new kind of laminopathy［J］.J Med Genet，2008，45（10）：666-671.DOI：10.1136/jmg.2008.060020.

［14］DUBE DK，MCLEAN MD，DUBE S，et al.Translational control of tropomyosin expression in vertebrate hearts［J］.Anat Rec（Hoboken），2014，297（9）：1585-1595.DOI：10.1002/ar.22978.

［15］MA X，ADELSTEIN RS.The role of vertebrate nonmuscle myosin II in development and human disease［J］.Bioarchitecture，2014，4（3）：88-102.DOI：10.4161/bioa.29766.

［16］UNGER S，MAINBERGER A，SPITZ C，et al.Filamin A mutation is one cause of FG syndrome［J］.Am J Med Genet A，2007，143A（16）：1876-1879.DOI：10.1002/ajmg.a.31751.

［17］SMEDTS HP，VAN UITERT EM，VALKENBURG O，et al.A derangement of the maternal lipid profile is associated with an elevated risk of congenital heart disease in the offspring［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2012，22（6）：477-485.DOI：10.1016/j.numecd.2010.07.016.

（編輯 武玉欣）

The Identification of Differentially Expressed Proteins in Maternal Serum of Fetuses with Congenital Heart Defects by Using the iTRAQ Technology

CHEN Lizhu1，MA Wei2，ZHANG Mo3，YUAN Zhengwei2

（1.Department of Ultrasound，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；3.Department of Urology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To screen for serum protein differentially expressed between women whose fetuses had congenital heart defects（CHD）and women who had normal fetuses.MethodsSerum samples were collected from pregnant women whose fetuses had CHD and those whose fetuses had no CHD，including a CHD group of 40 women and a control group of 10 women.The CHD group included 4 subgroups as follows:tetralogy of Fallot，ventricular septal defects，persistent truncus arteriosus，and a mixture of relatively rare types of CHD（n=10 each）.Samples in the same group were pooled to obtain equal amounts of proteins，and the iTRAQ proteomic approach was used to identify and quantify the proteins differentially expressed among these groups.ResultsWe successfully identified 606 proteins，among which 47 showed at least a 1.5-fold difference between the CHD and control groups.Among the 47 proteins，23 and 24 were upregulated and downregulated，respectively.ConclusionSeveral proteins associated with CHD could be identified by using the iTRAQ proteomic approach，and various proteins were involved in the pathogenesis of CHD in this study.

isobaric tag for relative and absolute quantitation；congenital heart defect；proteomics；serum biomarker；prenatal diagnosis

R541.1

A

0258-4646（2017）06-0510-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.007

國家自然科學基金青年基金項目（81600258）；國家重點研發計劃（2016YFC1000505）；國家自然科學基金（81671469）

陳驪珠（1984-），女，講師，博士.

袁正偉，E-mail：yuanzw@hotmail.com

2016-10-17

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