隋雨彤，趙尊全，王輝，鄭玉玲，劉鵬，姜永強(qiáng)

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物與流行病研究所，北京 100071

豬鏈球菌溶血素對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

隋雨彤，趙尊全，王輝，鄭玉玲，劉鵬，姜永強(qiáng)

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物與流行病研究所，北京 100071

目的：檢測(cè)天然豬鏈球菌溶血素（nSLY）對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，從而探討豬鏈球菌致宿主腦膜炎的發(fā)生機(jī)制。方法：使用豬鏈球菌野生株05ZYH33上清、sly基因敲除突變株ΔSLY上清、天然SLY蛋白分別與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3作用4 h后收集細(xì)胞，分別用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)hCMEC/D3細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，天然SLY蛋白可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）上調(diào)顯著促進(jìn)hCMEC/D3細(xì)胞發(fā)生凋亡，同樣含天然SLY的豬鏈球菌2型野生株05ZYH33上清也通過(guò)該途徑促進(jìn)hCMEC/D3細(xì)胞凋亡，但突變株ΔSLY上清則不能影響hCMEC/D3細(xì)胞的凋亡。結(jié)論：豬鏈球菌溶血素可以通過(guò)TNF-α促進(jìn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能是豬鏈球菌致腦膜炎的發(fā)病機(jī)制之一。

豬鏈球菌溶血素；腦膜炎；腫瘤壞死因子α；人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是近年新發(fā)現(xiàn)的人畜共患病的病原菌，可引起人和豬的腦膜炎、鏈球菌中毒休克綜合征（streptoccal toxic shock syndrome，STSS），具有較高的致殘和致死率[1-2]。目前對(duì)豬鏈球菌的研究主要側(cè)重于新的毒力基因的發(fā)現(xiàn)和鑒定上，已鑒定的毒力因子主要包括莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、豬鏈球菌溶血素（suilysin，SLY）、細(xì)胞外蛋白因子（extracellular factor，EF）和溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）等[3]。有報(bào)道顯示，SLY可以裂解和損傷多種細(xì)胞，并且它也是致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的最主要因素，提示其在豬鏈球菌入侵中樞系統(tǒng)和破壞血腦屏障的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。因此，研究豬鏈球菌致腦膜炎的致病機(jī)理，尋找豬鏈球菌致腦膜炎新的治療靶點(diǎn)具有重要意義和價(jià)值。

在本研究中，我們提取了天然SLY，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）、蛋白免疫印跡（Western blot）和細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)，試圖闡明SLY在豬鏈球菌致腦膜炎過(guò)程中的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

豬鏈球菌2型野生株05ZYH33、天然SLY蛋白（nSLY）由本室保存；sly基因敲除突變株ΔSLY由本室構(gòu)建保存；人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human cerebral microvascular endothelial cells，hCMEC）hCMEC/D3由法國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)衛(wèi)生研究院Pierre-Olivier Couraud教授饋贈(zèng)。

氯霉素、卡那霉素（Sigma公司）；THB培養(yǎng)基、AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（BD公司）；EBM-2內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LONZA公司）；F-actin Labeling Kit共聚焦熒光染料（BBI Life Sciences公司）；酵母粉（Oxoid公司）；Lenalidomide（Selleck公司）。

1.2 天然SLY的活性分析

用PBS洗過(guò)的紅細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)所用的健康人全血取自志愿獻(xiàn)血人，且獻(xiàn)血者在2周內(nèi)未服用抗凝藥物，全血用3.2%枸櫞酸鈉抗凝，倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)）制備成2%紅細(xì)胞懸液，然后加入不同濃度的nSLY蛋白，37℃下旋轉(zhuǎn)孵育1 h，取200 μL加入96孔酶聯(lián)板，用酶聯(lián)儀測(cè)定D540nm值作為溶血活性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞與細(xì)菌培養(yǎng)

hCMEC/D3用含5%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)基，在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)；豬鏈球菌2型野生株05ZYH33用THB培養(yǎng)基培養(yǎng)；sly基因敲除突變株ΔSLY用含5μg/mL氯霉素的THB培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

用 Viia7 PCR反應(yīng)儀對(duì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，反應(yīng)體系使用SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ。檢測(cè)所用上游引物為5'-TATGAGCCCATCTATCTG-3'，下游引物為5'-AATGATCCCAAAGTAGAC-3'。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

豬鏈球菌2型野生株05ZYH33上清、sly基因敲除突變株ΔSLY上清、nSLY蛋白分別與hCMEC/ D3細(xì)胞作用4 h后收集細(xì)胞上清，沸水浴5 min使蛋白充分變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE，用半干法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗，4℃旋轉(zhuǎn)振蕩過(guò)夜；用TBST洗滌3次，5 min/次，之后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；用TBST洗滌5次，5 min/次；顯色，光密度掃描定量分析。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用AnnenxinⅤ/FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。細(xì)胞收集后1000～2000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1次，棄上清，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100μL用AnnenxinⅤ標(biāo)記，室溫下避光孵育15 min，然后加入PI，室溫避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLY蛋白溶血活性分析

為了評(píng)價(jià)天然SLY蛋白的活性，確定合適的蛋白濃度來(lái)刺激人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用2%紅細(xì)胞檢測(cè)其溶血活性[5]，37℃作用1 h溶解1%細(xì)胞定義為一個(gè)溶血單位（HU）。根據(jù)結(jié)果（圖1），我們選用終濃度125 ng/mL的SLY蛋白作為本實(shí)驗(yàn)合適的濃度。

2.2 SLY蛋白誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），與對(duì)照組相比，天然SLY蛋白可導(dǎo)致hCMEC/D3細(xì)胞凋亡，提示SLY蛋白可誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

2.3 SLY蛋白引起hCMEC/D3細(xì)胞凋亡依賴于TNF-α

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌2型野生株05ZYH33可誘導(dǎo)hCMEC/D3產(chǎn)生較高水平的TNF-α[6]，提示豬鏈球菌2型野生株05ZYH33可能通過(guò)TNF-α破壞血腦屏障的完整性，引發(fā)腦膜炎。通過(guò)本研究我們發(fā)現(xiàn)SLY可引起人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，因此推測(cè)SLY蛋白可能是通過(guò)TNF-α促進(jìn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。qRT-PCR與Western印跡結(jié)果均顯示（圖3A），天然SLY蛋白刺激hCMEC/D3細(xì)胞后可引起TNF-α上調(diào)。為了確定SLY蛋白是否通過(guò)TNF-α引起細(xì)胞凋亡，我們加入TNF-α抑制劑Lenalidomide對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，qRT-PCR與Western印跡結(jié)果提示（圖3A），TNF-α抑制劑可以顯著抑制TNF-α的表達(dá)?；谝陨辖Y(jié)果，我們進(jìn)一步探討TNF-α與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3B），TNF-α抑制劑可以極大地降低細(xì)胞凋亡率。同時(shí)我們用Western印跡檢測(cè)凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子caspase-3的活性，結(jié)果表明（圖3C），與SLY蛋白刺激hCMEC/D3細(xì)胞后caspase-3的活性相比，用TNF-α抑制劑預(yù)處理的hCMEC/D3細(xì)胞的caspase-3的活性明顯降低。上述結(jié)果提示我們SLY蛋白引起hCMEC/D3細(xì)胞凋亡依賴于TNF-α。

3 討論

豬鏈球菌溶血素是膽固醇依賴型的細(xì)胞成孔毒素，是革蘭陽(yáng)性菌在感染宿主時(shí)分泌的一種重要的毒力因子[7-8]，可在富含膽固醇的細(xì)胞膜表面發(fā)生寡聚，進(jìn)而在細(xì)胞膜表面打孔，通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性而破壞細(xì)胞[9-10]，提示豬鏈球菌溶血素SLY可能通過(guò)引起內(nèi)皮細(xì)胞死亡破壞血腦屏障，但這一過(guò)程的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究表明，豬鏈球菌2型野生株05ZYH33上清可以明顯促進(jìn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但sly基因敲除突變株ΔSLY上清則不能影響人腦微血管細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，我們用提取的天然SLY蛋白直接刺激人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯增強(qiáng)，提示天然SLY蛋白可促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。由此我們推測(cè)，天然SLY蛋白通過(guò)誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞了血腦屏障的完整性，從而導(dǎo)致豬鏈球菌通過(guò)血腦屏障，引起炎癥、水腫及神經(jīng)損傷。

圖1 SLY蛋白活性分析

圖2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

作為血腦屏障的最重要的組成成分，人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮著較為重要的作用。血腦屏障是機(jī)體的一道重要屏障，其主要功能為阻止病原體和其他大分子物質(zhì)通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入腦組織，是一種具有選擇性通透作用的屏障[11-13]。雖然近年對(duì)豬鏈球菌的研究關(guān)注度明顯加強(qiáng)，但豬鏈球菌致腦膜炎的機(jī)制還未完闡明，多數(shù)研究針對(duì)影響血腦屏障毒力因子的篩選和功能發(fā)掘，而對(duì)豬鏈球菌是通過(guò)何種方式穿過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，破壞腦組織，導(dǎo)致腦膜炎的機(jī)制的研究較少。從感染豬鏈球菌到最終引發(fā)細(xì)菌性腦膜炎的過(guò)程中，其關(guān)鍵在于通過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方式。由于hCMEC/D3是血腦屏障的最關(guān)鍵組成部分，因此，研究豬鏈球菌與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，及其在此過(guò)程中引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜的變化，有助于我們發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致細(xì)菌性腦膜炎的機(jī)制。

圖3 SLY蛋白引起hCMEC/D3細(xì)胞凋亡依賴于TNF-α

我們以前的研究表明豬鏈球菌2型野生株05ZYH33可以促進(jìn)TNF-α的表達(dá)上調(diào)[6]，提示SLY蛋白可能是通過(guò)TNF-α引起細(xì)胞凋亡，從而破壞血腦屏障的完整性。TNF-α這一促炎細(xì)胞因子在誘發(fā)腦膜炎中的重要作用已得到越來(lái)越多的關(guān)注。作為一種重要的多效性細(xì)胞因子[14]，TNF-α被認(rèn)為是與腦膜炎發(fā)生和發(fā)展關(guān)系較為密切的介質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)天然SLY蛋白刺激hCMEC/D3細(xì)胞后可誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)天然SLY蛋白刺激hCMEC/D3細(xì)胞后可顯著促進(jìn)TNF-α表達(dá)上調(diào)。作為一個(gè)多效性細(xì)胞因子，TNF-α可以啟動(dòng)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[14]。有研究表明TNF-α可以激活NF-κB信號(hào)通路[6]，從而誘導(dǎo)大量與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，這提示我們SLY蛋白刺激hCMEC/D3細(xì)胞后可能通過(guò)改變TNF-α的表達(dá)水平，從而激活NF-κB信號(hào)通路，引發(fā)一些與凋亡相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為了證明這一推理，我們用TNF-α抑制劑檢測(cè)TNF-α對(duì)hCMEC/D3細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)用TNF-α抑制劑進(jìn)行預(yù)處理后可以極大地降低凋亡率。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase家族起著十分重要的作用，同時(shí)caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的多種途徑中都發(fā)揮著重要功能。正常情況下caspase-3以酶原（相對(duì)分子質(zhì)量為32 000）形式存在，但在細(xì)胞凋亡的早期階段可被激活，活化的caspase-3由2個(gè)大亞基（相對(duì)分子質(zhì)量為19 000）和2個(gè)小亞基（相對(duì)分子質(zhì)量為17 000）組成，通過(guò)裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-16]。為了進(jìn)一步證明TNF-α誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程，我們采用Western印跡檢測(cè)caspase-3的活性，證明SLY確實(shí)可以活化caspase-3，而TNF-α抑制劑可以降低caspase-3的活性。由此說(shuō)明SLY引起hCMEC/D3細(xì)胞凋亡依賴于TNF-α。但這一過(guò)程的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)，首次證明天然豬鏈球菌溶血素可以通過(guò)TNF-α誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，表明天然SLY蛋白是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而穿過(guò)血腦屏障，并引起腦膜炎的。這為豬鏈球菌致腦膜炎患者臨床治療提供了新的治療靶點(diǎn)，具有重要意義。

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Effects of Suilysin on Apoptosis of Human Cerebral Microvascular Endothelial Cells

SUI Yu-Tong,ZHAO Zun-Quan,WANG Hui, ZHENG Yu-Ling,LIU Peng*,JIANG Yong-Qiang*

State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China

*Co-corresponding authors,JIANG Yong-Qiang,E-mail:jiangyq@bmi.ac.cn;LIU Peng,E-mail:ammsliupeng@163.com

Objective:To explore the mechanism of meningitis caused byStreptococcus suis,we detect the effect of nativeS.suishemolysin（nSLY）on the apoptosis of human brain microvascular endothelial cells.Methods:We used wild strainsS.suis05ZYH33 supernatant,slyknockout mutant strains supernatant and native SLY protein to stimulate the human cerebral microvascular endothelial cells hCMEC/D3 respectively,and collected the cell after 4 h.Furtermore,flow cytometry and protein immunoblot technology were used to observe the apoptosis of the hCMEC/ D3.Results:Compared with control group,the natural SLY protein could promote significantly hCMEC apoptosis by inducing the expression of TNF-α.Consisting with the natural SLY protein,the wild strainsS.suis05ZYH33 supernatant also promote hCMEC/D3 apoptosis by the same way,butslyknockout mutant strains supernatant could not affect hCMEC/D3 apoptosis.Conclusion:Suilysin can promote the brain microvascular endothelial cells apoptosis induced by TNF-α,which may be one of the pathogenesis of meningitis caused byS.suis.

Streptococcus suissuilysin;meningitis;TNF-α;human brain microvascular endothelial cells;apoptosis

Q25

A

1009-0002（2017）03-0290-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.010

2016-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（81371766）

隋雨彤（1991-），女，碩士研究生，（E-mail）929199468@qq.com

姜永強(qiáng)，（E-mail）jiangyq@bmi.ac.cn；劉鵬，（E-mail）ammsliupeng@163.com