磁性富集熒光法檢測大腸桿菌

楊宇，牛承崗，曾光明

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磁性富集熒光法檢測大腸桿菌

楊宇，牛承崗，曾光明

(湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室，湖南長沙，410082)

為研究大腸桿菌的高靈敏快速檢測方法，建立一種基于萘酰亞胺標(biāo)記的DNA探針和磁性四氧化三鐵氧化石墨烯分離的大腸桿菌O157:H7檢測方法。將標(biāo)記萘酰亞胺的ssDNA(單鏈DNA)作為捕獲探針吸附在磁性氧化石墨烯表面，當(dāng)目標(biāo)ssDNA存在時，捕獲探針與之部分雜交，利用磁場將目標(biāo)ssDNA捕獲并富集。然后加入釋放探針完成雜交，使標(biāo)記熒光的捕獲探針從磁性氧化石墨烯的表面釋放出來，通過測定溶液熒光強度可以實現(xiàn)大腸桿菌O157:H7的高靈敏檢測。實驗結(jié)果表明：在一定條件下，O157:H7數(shù)量的對數(shù)值和熒光強度與空白值熒光強度的比值(/0)呈線性關(guān)系，線性范圍為150~1.5×106個/mL，經(jīng)過富集后檢出限可達100 個/mL。該方法靈敏度高，檢出限低，耗時較短，操作簡單，為致病菌的高靈敏檢測提供新思路。

大腸桿菌O157:H7；磁性氧化石墨烯；富集；DNA雜交；萘酰亞胺

腸出血性大腸桿菌(，EHEC)是人類食源性以及水源性病原體，食用被該菌污染的食物會導(dǎo)致腹瀉和腸炎，嚴(yán)重時將導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合癥，甚至死亡[1]。EHEC以大腸桿菌O157:H7血清型為代表菌株[2]。建立一種快速、準(zhǔn)確檢測大腸桿菌方法，對環(huán)境監(jiān)測和臨床醫(yī)學(xué)流行病學(xué)診斷有現(xiàn)實意義[3]。目前，檢測大腸桿菌的方法主要有傳統(tǒng)方法、免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)方法依賴于觀察表型特性，該方法耗時長，不適用于快速檢測[4]。免疫學(xué)檢測法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等方法，ELISA能對進行準(zhǔn)確、快速定量，但陽性結(jié)果需用培養(yǎng)法確認(rèn)[5]。分子生物學(xué)方法主要根據(jù)大腸桿菌DNA中的特異性基因來進行定性定量分析，分為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))和DNA探針檢測等方法[6?7]。PCR技術(shù)可以將部分DNA序列進行復(fù)制，信號放大，故靈敏度較高[8]。近幾年，磁性納米材料發(fā)展迅速，其中，磁性氧化石墨烯納米材料不僅具有優(yōu)良的磁學(xué)性能、良好的生物相容性以及水溶性等優(yōu)點，而且可以強烈地吸附ssDNA，且具有較強的熒光猝滅能力[9?11]。為了進一步研究DNA探針檢測方法在檢測細菌方面的應(yīng)用，提高檢測方法的靈敏度，本實驗結(jié)合磁性氧化石墨烯和DNA探針檢測方法的優(yōu)點，采用水溶性較好的N-羥乙基-4-N(氨乙基)-1,8-萘酰亞胺(4-N- aminoethyl-N-hydroxyethyl-1,8-naphthalimide，AHA)作為熒光物質(zhì)標(biāo)記大腸桿菌O157:H7的一段特異性ssDNA，將其作為捕獲探針C*，吸附在磁性四氧化三鐵/氧化石墨烯(MGO)表面。通過捕獲探針先后與目標(biāo)ssDNA和將捕獲探針從MGO表面釋放出來的ssDNA(釋放探針R)雜交，達到對O157:H7捕獲、富集和檢測的目的。實驗建立了用于實際樣品中大腸桿菌O157:H7快速檢測方法，并對實驗條件進行了優(yōu)化，該方法具有靈敏度高、快速簡便、經(jīng)濟、特異性好等優(yōu)點。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

儀器為：高壓蒸汽滅菌器(LDZX?30 FBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；酸度計(pHS?3B，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；熒光分光光度計(FluoroMax?4 Spetroflurometer，法國HORIBA Jobin Yvon公司)。

試劑為：PBS(phosphate buffered saline)緩沖液配制：3.05 g NaH2PO4·12H2O，8.00 g NaCl，0.20 g KH2PO4和0.20 g KCl，溶解于1 L超純水中(pH=7.2)。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制：10.0 g蛋白胨，5.0 g牛肉膏，5.0 g NaCl溶解于1 L超純水中(pH為7.0~7.2)。實驗所用培養(yǎng)基、緩沖液和超純水在使用前均滅菌。

1.2 捕獲探針，釋放探針和目標(biāo)ssDNA堿基序列

參考GenBank公布的大腸桿菌O157:H7的特異性基因片段及相關(guān)文獻介紹，本實驗設(shè)計了3條探針[12]。DNA序列采用軟件Primer Premier 5.0進行設(shè)計，并用Ribosomal Database Project II 和NCBI Blast 2數(shù)據(jù)庫提供的Probe Match軟件檢測序列的特異性。設(shè)計的DNA序列如下，捕獲探針C(capture probe C)：5′COOH-TTTTTTTTTTCATAGAACGCTAATAAGAAGTCCAGTG-3′；釋放探針R(release probe R)：5′-AAAAAAAAAA-3′；目標(biāo)堿基序列T(target DNA T)：5′-CACTGGACTTCTTATTACCGTTCTATG-3′。其中，捕獲探針C分為2段：一段與目標(biāo)堿基序列T互補，另一段與釋放探針R互補。所有DNA序列委托上海生物工程股份有限公司合成。

1.3 磁性氧化石墨烯的合成

本文所采用的MGO分2步合成：第1步合成GO，第2步GO與FeCl3在一定條件下反應(yīng)合成MGO。

GO根據(jù)Hummers方法制備[13]。

MGO的制備：稱取0.5 g用上述方法制備的GO，加入到80 mL乙二醇中超聲分散3 h。在室溫下加入1.6 g FeCl3和3.2 g醋酸鈉，攪拌30 min，將溶液轉(zhuǎn)移到100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓釜中200 ℃反應(yīng)6 h，然后自然冷卻到室溫。離心得到黑色固體，用乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥得MGO[14?15]。

1.4 捕獲探針的熒光標(biāo)記

N-羥乙基-4-N(氨乙基)-1,8-萘酰亞胺(AHA)由本課題組合成，該化合物具有強烈的熒光、較好的水溶性和熱穩(wěn)定性。首先，將1.3 mg AHA溶于適量PBS緩沖液中，然后加入50 nmol/L探針C和200 mg EDC，接著添加PBS緩沖液將溶液定量至10 mL。震蕩搖晃10 min后加入120 mg NHS，繼續(xù)震蕩搖晃2 h。接著放置在冰箱4 ℃過夜，讓未反應(yīng)的EDC水解失活。最后透析數(shù)次，除去未連接的AHA，得熒光標(biāo)記的捕獲探針C*[16]。

1.5 菌株的培養(yǎng)與細菌數(shù)量

大腸桿菌O157:H7菌株(No. NCTC 12900)購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢，中國)，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

本實驗使用平板菌落計數(shù)法對培養(yǎng)24 h的O157:H7進行定量檢測。將液體培養(yǎng)基中的O157:H7稀釋10，1×102，1×103，1×104，1×105，1×106，1×107和1×108倍，分別取100 μL溶液涂布在已滅菌的伊紅美藍培養(yǎng)基(EMB)表面，恒溫培養(yǎng)24 h，之后進行菌落計數(shù)，確定細菌數(shù)量。

1.6 大腸桿菌O157:H7DNA提取

使用GenerayTM基因提取試劑盒提取經(jīng)過24 h培養(yǎng)的O157:H7的DNA。DNA提取出來后，用PBS緩沖液將其稀釋為若干個濃度備用，為后面的雜交試驗做準(zhǔn)備。

1.7 雜交試驗及熒光檢測

本實驗用合成的T對各實驗條件進行了優(yōu)化，并且探討了實驗的可行性。在最佳實驗條件下，用大腸桿菌提取得到的DNA驗證了該方法的實際應(yīng)用效果。首先，50 nmol/L 捕獲探針C*與0.18 g/L MGO混合1 h，得C*-MGO溶液。同時，將用試劑盒提取出來的DNA加熱到95 ℃保持5 min，然后迅速浸泡在冰水里5 min，以打開雙鏈，得到目標(biāo)ssDNA T。接著將不同濃度的T分別加到C*-MGO溶液中，放置在50.6 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育2.5 h完成部分雜交。接著放置在磁場中10 min，收集磁性顆粒，移除原溶液，加入200 nmol/L 釋放探針R，此時溶液體積為原體積的1/4，相當(dāng)于富集4倍，在室溫下雜交2 h，完成雜交試驗。雜交后探針C*從MGO表面釋放，磁性分離石墨烯，通過檢測熒光變化，可對O157:H7進行定量分析。

所有實驗均作3個平行樣，滅菌超純水代替T為空白對照。熒光儀的儀器參數(shù)：激發(fā)波長ex=450 nm，發(fā)射波長em=540 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

在MGO溶液中，由于MGO對ssDNA強烈的吸附作用，當(dāng)捕獲探針C*存在時，C*吸附于MGO表面。此時標(biāo)記于C*一端的AHA與MGO發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，熒光猝滅，如圖1(a)所示。接著加入目標(biāo)ssDNA T，由于捕獲探針C*的一段DNA序列與T互補，C*與T完成部分雜交，雙鏈部分脫離MGO表面，如圖1(b)所示。接著利用磁場收集磁性顆粒，移除原溶液，再加入少量釋放探針R溶液進行雜交。C*完全脫離MGO表面，熒光恢復(fù)。磁性分離石墨烯后通過檢測溶液熒光變化對O157:H7的進行定量分析。如圖1(c)所示。

2.2 MGO對捕獲探針的吸附

圖2所示為不同質(zhì)量濃度的MGO下熒光猝滅光譜。在本實驗中，MGO作為一種熒光猝滅劑，其對捕獲探針C*的吸附情況可以根據(jù)熒光強度的變化來判斷。本實驗研究了不同質(zhì)量濃度MGO對熒光強度猝滅情況，并對吸附時間做出優(yōu)化。捕獲探針C*濃度取50 nmol/L，當(dāng)MGO質(zhì)量濃度在0~0.27 g/L之間變化時，熒光猝滅效果隨濃度增大而增強，如圖2所示。圖3顯示當(dāng)質(zhì)量濃度為0.18 g/L時，猝滅效率高達96 %。本實驗選取0.18 g/L為最佳吸附質(zhì)量濃度。

圖1 基于N-羥乙基-4-N(氨乙基)-1,8-萘酰亞胺熒光探針與磁性氧化石墨烯檢測大腸桿菌O157:H7示意圖

質(zhì)量濃度/(mg?mL?1): 1—0; 2—0.03; 3—0.05; 4—0.12; 5—0.18; 6—0.21。

圖3 不同質(zhì)量濃度MGO下熒光猝滅效率圖

本實驗還探討MGO對捕獲探針C*吸附效果達到最優(yōu)所需要的時間。將0.18 g/L MGO與50 nmol/L C*混合，記錄熒光強度，結(jié)果見圖4。在30 min以內(nèi)，熒光強度迅速減小。30 min到1 h階段，熒光強度緩慢減小到4%，此后基本保持不變。本實驗選取1 h為最佳捕獲探針C*吸附時間。

圖4 熒光強度隨吸附時間的變化

2.3 雜交溫度與時間的優(yōu)化

實驗首先對雜交溫度進行了優(yōu)化。捕獲探針C*與目標(biāo)單鏈T雜交的溫度從最適復(fù)性溫度(or=m? 25)、苛刻復(fù)性溫度s=m?10或s=m?15及非苛刻復(fù)性溫度ns=m?30或ns=m?35中選擇。本實驗中研究的探針m=60.6 ℃，故or=35.6 ℃，s=50.6 ℃以及ns= 25.6 ℃。實驗在對上述3種溫度下的雜交情況進行研究，MGO質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL，雜交時間為2.5 h，富集倍數(shù)為4，C*-MGO濃度為50 nmol/L，T濃度為10 nmol/L。實驗結(jié)果見圖5，在50.6 ℃熒光強度達到最高。原因可能是低溫下高分子量的DNA難以很好地展開，導(dǎo)致不能完全雜交配對[17]。

圖5 雜交溫度優(yōu)化

雜交時間決定著雜交是否完全，是雜交反應(yīng)的重要影響因子之一。本實驗將10 nmol/L T與50 nmol/L C*-MGO在50.6 ℃培育雜交，每隔0.5 h記錄熒光強度(富集倍數(shù)為4)。如圖6所示，反應(yīng)開始后，熒光強度隨反應(yīng)時間快速上升，2.0 h后增長變緩，2.5 h后，熒光強度基本不變。而對照的空白實驗中，熒光值一直較為平穩(wěn)。故本實驗選取雜交時間為2.5 h較為 合適。

1—實驗組；2—空白對照組。

2.4 富集倍數(shù)對實驗結(jié)果的影響

由于DNA含量低，檢測困難，本實驗利用MGO將待測目標(biāo)物捕獲并富集，通過對待測目標(biāo)物的富集，進而放大熒光強度，提高靈敏度。本實驗對富集倍數(shù)進行了優(yōu)化。將50 nmol/L C*-MGO與10 nmol/L T在50.6 ℃雜交2.5 h。檢測富集1倍、2倍、3倍、4倍、5倍的熒光強度，結(jié)果見圖7。由圖7可見：隨著富集倍數(shù)增加，熒光強度顯著增加，空白值緩慢增加?？瞻字德杂性黾拥脑蚩赡苁请S著富集倍數(shù)增加，溶液體積縮小，背景熒光物質(zhì)濃度增加，檢測出的熒光強度也隨之增加。圖8所示為實驗組的熒光強度與空白對照組熒光強度的比值(/0)變化情況。由圖5可見：在4倍富集時，達到最優(yōu)。

圖7 熒光強度隨富集倍數(shù)的變化

圖8 熒光強度比值(F/F0)隨富集倍數(shù)的變化

2.5 檢測方法的線性范圍與靈敏度

本實驗對從上海生工購買的目標(biāo)DNA序列和從本實驗培養(yǎng)的O157:H7提取出的DNA進行了研究，所有實驗均在最優(yōu)實驗條件下進行。圖9和圖10所示為隨著濃度增大(0~500 nmol/L)，目標(biāo)序列ssDNA T的/0變化情況。實驗在T濃度為50 pmol/L到30 nmol/L呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(=0.229+1.729，2=0.989 8，其中，為目標(biāo)DNA的濃度，為/0)。本實驗空白組相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%，根據(jù)空白值3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算[18]，檢出限為50 pmol/L。

實驗對培養(yǎng)的O157:H7進行了檢測。在最優(yōu)條件下，測得的熒光強度比(/0)隨相應(yīng)O157:H7數(shù)量的變化曲線如圖11所示。隨著O157:H7數(shù)量的增加，熒光強度逐漸增大。實驗結(jié)果表明：O157:H7數(shù)量在150~1.5×106個/mL范圍內(nèi)，O157:H7數(shù)量的對數(shù)lg(個/mL)和/0呈良好的線性關(guān)系，線性方程為=1.947 9?2.798 1(為細菌數(shù)量的對數(shù)，為/0)，2=0.991 0，空白值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%，檢出限為100 個/mL。

濃度/(nmol?L?1): 1—0; 2—0.5; 3—4; 4—17; 5—35; 6—100; 7—200; 8—500。

圖10 不同濃度T和熒光強度比值(F/F0)的關(guān)系

O157:H7含量/(個?mL?1): 1—1.5×107; 2—1.5×106; 3—1.5×1074; 4—1.5×103; 5—15。

3 結(jié)論

1) 磁性富集熒光法檢測大腸桿菌的體系中，最優(yōu)試驗條件如下：MGO質(zhì)量濃度為0.18 g/L，吸附時間為1.0 h，DNA探針雜交時間2.5 h，雜交溫度50.6 ℃，富集倍數(shù)為4倍。

2) 在檢測大腸桿菌O157:H7的實際應(yīng)用中，該方法靈敏度高、檢出限低、耗時較短，不需要PCR擴增，不需要通過其他手段可實現(xiàn)信號放大，可在5.0 h內(nèi)檢出細菌含量為100 個/mL。

3) 該方法為O157:H7的檢測提供了一種新方法，為其他致病菌的檢測提供了新思路，在環(huán)境監(jiān)測和食品衛(wèi)生領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

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(編輯 陳愛華)

Fluorescent detection ofbased on magnetic enrichment

YANG Yu, NIU Chenggang, ZENG Guangming

(Key Laboratory of Environmental Biology Pollution Control, Ministry of Education, School of Environmental Science Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China)

A novel sensitive assay was investigated for the highly sensitive and rapid detection ofO157:H7. It was based on magnetic Fe3O4/graphene oxide (MGO) and DNA probes which was modified by 4-N-aminoethyl-N- hydroxyethyl-1,8-naphthalimide (AHA). First, the ssDNA labelled with AHA was employed as a capture probe and adsorbed on the surface of MGO. When the target ssDNA appeared, capture probe hybridized with it in part. Then target ssDNA was fished and enriched via external magnetization. Afterwards, a solution of release probe was added to the magnetic particles to complete the hybridization which resulted in separating the AHA from MGO. The results show that the linear relationship is found between logarithm value of E.coli and the ratio of fluorescence intensities (/0) from 150 to 1.5×106/mL. The detection limit is 100 cfu/mL. The highly sensitive, rapid and simple means is demonstrated to be a noble tool for the detection of pathogenic bacteria.

O157:H7; magnetic Fe3O4/graphene oxide; enriching; DNA hybridization; 4-N-aminoethyl- N-hydroxyethyl-1,8-naphthalimide

10.11817/j.issn.1672-7207.2017.05.002

X831；X839.2

A

1672?7207(2017)05?1134?07

2016?07?22；

2016?09?04

國家自然科學(xué)基金資助項目(51541801) (Project(51541801) supported by supported by the National Natural Science Foundation of China)

牛承崗，博士，教授，從事分析化學(xué)和水污染處理研究；E-mail: cgniu@hnu.edu.cn