非小細胞肺癌患者血漿PKM2檢測的臨床意義

蘇鵬 陳海洋

·論著·

非小細胞肺癌患者血漿PKM2檢測的臨床意義

蘇鵬 陳海洋

目的 檢測非小細胞肺癌(NSCLC)患者血漿丙酮酸激酶M2(PKM2)水平，并對其臨床應用價值進行探討。方法 選取確診為NSCLC并行根治性手術的患者94例為手術組；確診為手術后復發(fā)的NSCLC患者30例為復發(fā)組；以正常體檢者50例為對照組。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組血漿丙酮酸激酶2(PKM2)的水平，同時檢測各組單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4(MCT4)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)的水平。繪制手術組術前及復發(fā)組血漿PKM2的ROC曲線。結果 血漿PKM2、GLUT1水平3組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，由高到低依次為復發(fā)組、手術組(術前)、對照組(P<0.05)；血漿MCT4水平在復發(fā)組、手術組(術前)均高于對照組(P<0.05)，而復發(fā)組與手術組(術前)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。手術組患者術后3個指標水平均明顯下降，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Spearman相關分析顯示，手術組術前檢測中這3個指標間均存在正相關性(P<0.05)；復發(fā)組中血漿PKM2與GLUT1、PKM2與MCT4存在正相關(P<0.05)，而MCT4與GLUT1則無明顯相關性(P>0.05)。手術組術前PKM2檢測ROC曲線最佳cut-off值為15.78 U/ml，曲線下面積0.873，對診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為69.1%、94.0%；復發(fā)組曲線最佳cut-off值為16.87 U/ml，曲線下面積為0.965，對診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為83.3%、98.0%。結論 NSCLC患者術前及復發(fā)時血漿PKM2水平明顯升高，檢測血漿PKM2水平對診斷NSCLC及預測腫瘤復發(fā)有意義。PKM2可能與MCT4、GLUT1相互調(diào)節(jié)而參與了NSCLC的進展及復發(fā)。

非小細胞肺癌;丙酮酸激酶M2;單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4;葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1;腫瘤標志物

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌中的大部分，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌等病理類型。近年來隨著我國社會進步，肺癌暴露因素也越來越多，因而NSCLC的發(fā)病率一直呈上升趨勢，嚴重危害人民的健康[1]。NSCLC的相關危險因素包括空氣污染、不良生活習慣(吸煙)、職業(yè)暴露、電離輻射、遺傳因素等，這些因素導致NSCLC患者不斷增多[2,3]。由于NSCLC沒有明顯的特異性癥狀，因而大多數(shù)患者就診時均已處于晚期[4]，很難達到根治，導致生存率低、預后差。因而對NSCLC進行早期診斷有重要意義。另外，NSCLC手術后經(jīng)常出現(xiàn)復發(fā)[5]，這也是臨床醫(yī)師常見的問題。迄今已有研究報道可溶性Toll樣受體4(Soluble Toll-like receptor 4)、DR70等指標對NSCLC的診斷及復發(fā)有意義，但準確性還有待于進一步提高[6,7]。因而選取準確性高的新指標早期預測NSCLC的復發(fā)有重要意義。丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)在糖酵解過程中發(fā)揮了重要作用。有研究顯示，PKM2在腫瘤中表達增高[8]，可以增加腫瘤細胞核酸的生成并促進腫瘤細胞的糖酵解，對腫瘤的進展有促進作用[9]。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿PKM2表達異常，但在患者的不同階段及不同疾病狀態(tài)下PKM2的具體情況如何報道罕見。為了解血漿PKM2在不同NSCLC患者的表達水平，本研究應用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)對NSCLC手術患者術前術后PKM2水平進行了檢測，同時檢測了復發(fā)NSCLC患者及正常對照者的PKM2水平，通過對不同組PKM2的檢測，為應用PKM2診斷NSCLC及預測復發(fā)提供了依據(jù)。為了解PKM2在NSCLC患者中的作用機制，本研究還檢測了血漿單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4(monocarboxylate transporter 4,MCT4)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)的水平，對3個指標的關系及意義進行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2016年7月我院就診住院并行手術確診為NSCLC的患者94例為手術組?；颊呔谐l(fā)腫瘤，有術后病理學診斷，其中鱗狀細胞癌57例，腺癌30例，大細胞癌7例?；颊咧心?6例，女28例；年齡41～74歲，中位年齡53歲?；颊咝g前均未接受過放化療、靶向治療等針對腫瘤的治療措施。同期于我科就診的手術后復發(fā)的NSCLC患者30例為復發(fā)組，患者均曾接受過NSCLC根治性手術，入組前有影像學檢查及活檢病理確診為NSCLC復發(fā)。復發(fā)組患者男19例，女11例；年齡44～71歲，中位年齡54歲。另取同期于我院進行體檢的正常人(體檢指標正常，無慢性疾病史及用藥史)50例為對照組。3組性別比、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究得到所有患者的知情同意，研究得到本醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 標本采集 3組入選者均抽取空腹靜脈血5 ml，留取血漿用于檢測PKM2、MCT4、GLUT1水平。手術組在術前1 d、手術后1個月各取血1次。復發(fā)組、對照組均取血1次。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測PKM2、MCT4、GLUT1在各組血漿中的表達 ELISA試劑盒均為美國MyBioSource公司產(chǎn)品。檢測嚴格按試劑盒說明書進行操作。應用瑞士Hamilton Bonaduz公司的全自動酶標儀讀取結果。

2 結果

2.1 血漿中PKM2、MCT4、GLUT1在手術組(術前)、復發(fā)組及對照組表達水平 血漿PKM2、GLUT1水平3組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，由高到低依次為復發(fā)組、手術組(術前)、對照組(P<0.05)；血漿MCT4水平在復發(fā)組、手術組(術前)均高于對照組(P<0.05)，而復發(fā)組與手術組(術前)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別PKM2(U/ml)MCT4(ng/ml)GLUT1(ng/ml)手術組術前(n=94)17.36±3.88*#19.10±4.73*1.21±0.42*#復發(fā)組(n=30) 20.80±3.96*20.58±5.70*1.56±0.38*對照組(n=50) 11.80±2.839.67±3.100.61±0.20F值65.80184.72873.890P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與復發(fā)組比較，#P<0.05

2.2 手術組術前及術后血漿中PKM2、MCT4、GLUT1水平比較 手術組患者術后3個指標水平均明顯下降，明顯低于術前(P<0.05)，但與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 血漿中PKM2、MCT4、GLUT1表達的關系 手術組術前3個指標間均存在正相關性，PKM2與MCT4、PKM2與GLUT1、MCT4與GLUT1之間均存在正相關(r=0.4226,P<0.001;r=0.3675,P<0.001;r=0.4008,P<0.001)；在復發(fā)組中血漿PKM2與GLUT1、PKM2與MCT4存在正相關(r=0.4162,P=

時間PKM2(U/ml)MCT4(ng/ml)GLUT1(ng/ml)手術組術前17.36±3.8819.10±4.731.21±0.42手術組術后12.21±3.2610.78±3.610.63±0.19t值10.63313.55712.199P值<0.001<0.001<0.001

0.022;r=0.3988,P=0.029)，而MCT4與GLUT1則無明顯相關性(r=0.3356,P=0.070)。

2.4 以血漿PKM2對NSCLC診斷及復發(fā)預測的ROC曲線結果 手術組術前PKM2檢測的ROC曲線最佳cut-off值為15.78 U/ml，曲線下面積0.873，對診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為69.1%、94.0%；復發(fā)組曲線最佳cut-off值為16.87 U/ml，曲線下面積0.965，對診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為83.3%、98.0%。見圖1。

圖1 血漿PKM2對NSCLC診斷及復發(fā)預測的ROC曲線

注：A:PKM2對NSCLC診斷的ROC曲線; B:PKM2對NSCLC復發(fā)預測的ROC曲線

3 討論

隨著我國社會的不斷進步，人們接觸的肺癌(lung cancer,LC)相關危險因素也不斷增多，大氣污染、相關職業(yè)接觸(如石棉開采、金屬冶煉等)、吸煙、呼吸系統(tǒng)感染、放射線、遺傳等都是肺癌的危險因素，因而近年來肺癌的發(fā)病率及死亡率不斷上升，目前肺癌已居于各種惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率首位[10]。在肺癌中最常見的就是NSCLC，占所有肺癌的80%以上。NSCLC早期僅有咳嗽、胸部不適等非特異性癥狀，很難引起患者的注意，因而易于誤診及漏診。待癥狀明顯就診時多已處于晚期，難以達到根治，治療效果不佳，預后差。同樣，NSCLC患者即使接受了根治性手術，大部分患者也會在術后出現(xiàn)復發(fā)，導致患者死亡。因此，尋找新的指標對NSCLC患者進行疾病診斷及復發(fā)預測有重要意義。有關NSCLC標志物的研究已開展多年，有報道發(fā)現(xiàn)多效因子(pleiotrophin)對NSCLC早期診斷有幫助[11]，還有報道發(fā)現(xiàn)Dickkopf-1對預測NSCLC復發(fā)有幫助[12]。但目前這些指標的診斷效果還不能令人滿意，故有必要選取新的指標進行評價并對其機制進行研究。

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解過程中的重要限速酶，可以使烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，還可使ADP轉(zhuǎn)化為ATP，在糖代謝過程中發(fā)揮了重要作用。PK為一個酶家族，包括M和L兩種同工酶。M型同工酶又包括PKM1和PKM2兩種亞型，其中PKM2具有較為廣泛的分布特點，在多種組織中存在。PKM2基因位于染色體8q24，包括16個外顯子，除發(fā)揮催化酶作用外，還發(fā)揮了多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控及蛋白翻譯、修飾作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)PKM2在喉癌、食管癌、胃癌、結直腸癌組織中表達異常[14-17]。研究還發(fā)現(xiàn)PKM2在肺癌、結直腸癌外周血中表達異常[18,19]。這些結果說明PKM2與多種惡性腫瘤有關，還有作為腫瘤標志物的可能。但PKM2在不同NSCLC表達情況及意義還不完全明確。本研究結果顯示，術前NSCLC患者血漿PKM2水平高于對照組，說明PKM2與NSCLC有關；研究還發(fā)現(xiàn)手術后血漿PKM2水平下降至正常水平，提示血漿PKM2水平與腫瘤狀態(tài)有關，在原發(fā)腫瘤去除后PKM2產(chǎn)生也減少。研究還發(fā)現(xiàn)復發(fā)NSCLC患者血漿PKM2水平更高，提示NSCLC患者血漿PKM2檢測可能作為預測NSCLC復發(fā)的標志物。

為初步了解PKM2在NSCLC中的作用機制，本研究還檢測了血漿單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4(monocarboxylate transporter 4,MCT4)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)的水平。MCT4是MCT家族的成員之一，MTC家族具有調(diào)節(jié)營養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)機體代謝、調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)境等作用，還與腫瘤的發(fā)生進展有關。有研究顯示MCT4在乳腺癌細胞中表達增高[20]，還有研究發(fā)現(xiàn)PKM2具有調(diào)節(jié)MCT4的作用[21]，但有關血漿MCT4與NSCLC的關系報道很少。GLUT1是GLUTs家族成員，參與細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運過程。有研究顯示，GLUT1在多種腫瘤中表達增強，研究認為這是由于GLUT1協(xié)助腫瘤細胞增強了對葡萄糖的攝取轉(zhuǎn)運功能，因而促進了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[22]。還有研究顯示，抑制腫瘤細胞中PKM2表達可以使GLUT1表達降低，提示PKM2對GLUT1有促進作用[23]。而NSCLC患者血漿中GLUT1表達情況及與PKM2的關系還不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，血漿MCT4水平在復發(fā)組、手術組(術前)均高于對照組，而復發(fā)組與手術組(術前)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；GLUT1水平3組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，由高到低依次為復發(fā)組、手術組(術前)、對照組。這些結果提示MCT4、GLUT1可能也參與了NSCLC的進展和復發(fā)過程。研究還發(fā)現(xiàn)在手術組術前檢測中這3個指標間均存在正相關性；在復發(fā)組中血漿PKM2與GLUT1、PKM2與MCT4存在正相關，這些結果提示PKM2可能通過與MCT4、GLUT1相互調(diào)控而在NSCLC的進展和復發(fā)過程中發(fā)揮了作用，但其間具體的調(diào)控機制還有待深入研究。

為進一步分析血漿PKM2作為診斷NSCLC和預測復發(fā)的意義，我們根據(jù)術前及復發(fā)NSCLC患者的血漿PKM2水平繪制了ROC曲線。ROC曲線作為診斷試驗評價指標在臨床工作中得到了廣泛應用。應用ROC曲線可以對新指標檢測的意義進行評價，還可以確定最佳截點(cut-off值)[24]。本結果顯示，手術組術前PKM2檢測的ROC曲線最佳cut-off值為15.78 U/ml，曲線下面積0.873，對診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為69.1%、94.0%；復發(fā)組曲線最佳cut-off值為16.87 U/ml，曲線下面積0.965，對診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為83.3%、98.0%。因此，我們認為以血漿PKM2高于15.78 U/ml作為NSCLC診斷的界值，以高于16.87 U/mL作為預測NSCLC復發(fā)的界值應用于NSCLC診斷及復發(fā)預測有重要的臨床價值。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)血漿PKM2在術前NSCLC患者水平高于正常對照組，在復發(fā)組水平更高；手術后血漿PKM2水平下降至正常。提示血漿PKM2對于反映NSCLC患者疾病狀態(tài)及預測復發(fā)有益。研究還發(fā)現(xiàn)血漿PKM2、MCT4、GLUT1之間存在調(diào)控關系。本研究結果提示血漿PKM2水平對診斷NSCLC及預測腫瘤復發(fā)有意義，PKM2可能與MCT4、GLUT1相互調(diào)節(jié)而參與了NSCLC的進展及復發(fā)。但具體情況還需要擴大研究規(guī)模并進行機制研究才能進一步確定。

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Clinical significance of detection of plasma PKM2 in patients with NSCLC

SUPeng,CHENHaiyang.

DepartmentofThoracicSurgery,CentralHospitalofLiaoyangCity,Liaoning,Liaoyang111000,China

Objective To investigate the levels of plasma pyruvate kinase M2 (PKM2) in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC),and to evaluate its clinical significance.Methods Ninety-four patients with NSCLC who underwent radical operation were enrolled as surgery group,and the other 30 patients who were diagnosed as postoperative relapse were enrolled as relapse group,at the same time, 50 healthy subjects were served as control group.The plasma levels of PKM2 were detected by ELISA assay,meanwhile, the plasma levels of MCT4 and GLUT1 were detected.Moreover the ROC curves of plasma PKM2 were drawn in both groups.Results There were significantly differences in levels of plasma PKM2,GLUT1 among the three groups (P<0.05),the order from high to low was relapse group,surgery group before operation,control group (P<0.05). The plasma levels of MCT4 in relapse group and surgery group before operation were significantly higher than those in control group (P<0.05), however, there were no significantly differences between relapse group and surgery group before operation (P>0.05). The levels of PKM2,GLUT1,MCT4 in surgery group were significantly decreased after operation (P<0.05),but there were no significant differences between surgery group and control group (P>0.05). Spearman correlation analysis showed that there was a positive correlation among the three indexes in surgery group before operation (P<0.05). The plasma levels of PKM2 in relapse group were positivelty correlated to those of GLUT1,MCT4 (P<0.05),but the levels of MCT4 were not correlated to those of GLUT1 (P>0.05). The optimal cut-off value of PKM2 in surgery group before operation was 15.78U/ml, with the area under curve being 0.873,and sensitivity and specificity in diagnosis of NSCLC were 69.1%,94.0%,respectively.The optimal cut-off value of PKM2 in relapse group was 16.87U/ml,with the area under curve being 0.965,and sensitivity and specificity in diagnosis of NSCLC were 83.3%,98.0%,respectively.Conclusion The plasma levels of PKM2 are obviously increased in patients with NSCLC before operation and at relapse period,therefor,it is valuable to detect plasma levels of PKM2 for diagnosis of NSCLC and prediction of relapse of tumor. Moreover PKM2 may be involved in progress and relapse of NSCLC by regulation with MCT4 or GLUT1 each other.

non-small cell lung cancer; pyruvate kinase M2; monocarboxylate transporter 4; glucose transporter 1; tumor markers

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.11.006

111000 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院胸外科

陳海洋，111000 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院胸外科；

E-mail:466513444@qq.com

R 734.2

A

1002-7386(2017)11-1623-04

2016-12-16)