紅花黃色素聯合二甲雙胍對早期糖尿病腎病患者NF-κB炎癥信號通路的影響

鮑喜靜 李建英 彭一 董陸玲 唐宏霞 楊秀紅 王新婷 辛麗娟 張翠靜 吳嘉鳴

·論著·

紅花黃色素聯合二甲雙胍對早期糖尿病腎病患者NF-κB炎癥信號通路的影響

鮑喜靜 李建英 彭一 董陸玲 唐宏霞 楊秀紅 王新婷 辛麗娟 張翠靜 吳嘉鳴

目的 觀察紅花黃色素聯合二甲雙胍治療早期糖尿病腎病(DN)的臨床療效及對患者血清NF-κB炎癥信號通路的影響。 方法 選取2015年10月至2016年10月診治的DN患者80例，隨機分為對照組和觀察組，每組40例，2組均接受常規治療，對照組在常規治療基礎上口服鹽酸二甲雙胍治療，觀察組在對照組基礎上靜脈滴注紅花黃色素。療程均為2周。觀察2組臨床療效及治療前后血清NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平變化。結果 對照組和觀察組總有效率分別為57.50%、87.50%，觀察組總有效率較對照組顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05)。與治療前比較，2組治療后NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達及hs-CRP、TNF-α、IL-6水平明顯降低，且觀察組上述指標降低程度優于對照組(P<0.05)。結論 紅花黃色素聯合二甲雙胍治療早期糖尿病腎病療效顯著，其機制與抑制NF-κB炎癥信號通路的活化及炎性因子釋放有關。

紅花黃色素；二甲雙胍；糖尿病腎??；核因子κB

糖尿病腎病(diabetic nephrology，DN)是糖尿病患者中主要的微血管病變之一，是導致發生終末期腎病和糖尿病患者致死的重要原因[1]。近年研究認為，DN是一種由多種炎性介質共同參與的慢性、炎癥性疾病，其中核因子κB(NF-κB)的活化和轉位在炎性反應及DN發生發展過程中發揮關鍵作用[2,3]。因此，阻斷炎癥機制對于抑制或延緩DN進展至關重要[4,5]。本研究探討了紅花黃色素聯合二甲雙胍治療DN的臨床療效及對患者血清NF-κB炎癥信號通路的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月至2016年10月我院收治的DN患者80例，隨機分為對照組和觀察組，每組40例。對照組男22例，女18例；年齡35～71歲，平均年齡(50.45±7.12)歲；病程6～17年，平均(8.26±1.13)年。觀察組男23例，女17例；年齡 33～70歲，平均年齡(49.74±7.03)歲；病程7～16年，平均(9.06±1.20)年。2組年齡、性別比、病程等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=40

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準：①符合2010年美國糖尿病學會制定的2型糖尿病診斷標準；②符合2013年第八版《內科學》制定的早期DN診斷標準，即尿白蛋白排泄率持續性增加超過20～200 μg/min；③發病持續時間超過1年；④所有患者簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者；②高血壓、尿路結石等疾病引起的尿蛋白增加者；③自身免疫性疾病、惡性腫瘤患者；④藥物過敏患者。

1.3 治療方法 2組均進行糖尿病宣教、低蛋白飲食、適量運動等常規治療。對照組在常規治療基礎上口服鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司)，2 g/d，分次口服。觀察組在對照組基礎上加用紅花黃色素(浙江永寧藥業股份有限公司，批號 220050146)，100 mg紅花黃色素溶于250 ml 0.9%氯化鈉溶液中靜脈滴注，1次/d。療程均為2周。

1.4 觀察指標 觀察2組臨床療效及治療前后血清NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平變化。

1.5 療效判定標準[6]顯效：患者高血壓、水腫、蛋白尿等癥狀體征明顯改善，FBG、2 hPG降低幅度超過1/3或接近正常，腎功能正常；有效：患者高血壓、水腫、蛋白尿等癥狀體征有一定程度改善，FBG、2 hPG降低幅度未達到顯效標準，腎功能正常；無效：患者高血壓、水腫、蛋白尿等癥狀體征無改善，FBG、2 hPG水平沒有明顯變化。總有效率=(顯效+有效)例數/總例數×100%。

1.6 檢測方法

1.6.1 標本采集:分別于治療前后抽取患者清晨空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存備用。

1.6.2 Real time-PCR:根據GeneBank中人NF-κB p50、p65 mRNA序列，采用Primer軟件設計引物，由上海生物工程有限公司合成。Trizol提取患者外周血總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度，按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA第1鏈。PCR反應在ABI 7300型實時熒光定量PCR儀上進行，擴增完畢后進入儀器自帶的SDS v1.3軟件結果分析界面，使用SPSS 10.0統計計算樣品間Ct值。設對照組樣品為標準1，目的基因mRNA相對表達水平為2-ΔΔCt，設β-actin為內參照基因。見表2。

表2 Real time-PCR引物序列及擴增產物長度

1.6.3 Western-blot:外周血加入紅細胞裂解液200 μl，冰上放置30 min充分裂解細胞，3 000 r/min離心15 min，棄上清。加入RIPA液提取細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，每組取100 μg總蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，將目的蛋白電轉移至PVDF膜，10%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h。加入特異性一抗孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，ECL化學發光法顯色、定影。設β-actin為內參照基因，以NF-κB p50、p65與β-actin的比值表示二者相對表達水平。

1.6.4 ELISA法:采用ELISA法測定血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。在酶標儀450 nm 波長處測定各孔吸光度值(OD值)，根據說明書提供的標準品濃度及測得的OD值得到標準曲線的直線回歸方程，即可計算出各樣品濃度。

2 結果

2.1 2組臨床療效比較 對照組顯效8例，有效15例，無效17例，總有效率57.50%(23/40)；觀察組顯效15例，有效20例，無效5例，總有效率87.50%(35/40)，與對照組比較，觀察組總有效率顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組臨床療效比較 n=40,例

注：與對照組比較,*P<0.05

2.2 2組NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達比較 2組治療前NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達均較治療前顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組降低程度優于對照組(P<0.05)。見表4。

組別NF-κBp50mRNA蛋白NF-κBp65mRNA蛋白對照組 治療前1.86±0.241.79±0.213.14±0.463.00±0.38 治療后1.35±0.18*1.24±0.15*2.66±0.39*2.57±0.28*觀察組 治療前1.88±0.251.80±0.223.12±0.423.02±0.36 治療后0.99±0.13*0.82±0.11*#1.97±0.23*1.86±0.20*#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

2.3 2組炎性因子水平比較 2組治療前hs-CRP、TNF-α、IL-6水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后hs-CRP、TNF-α、IL-6水平均較治療前顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組降低程度優于對照組(P<0.05)。見表5。

組別hs-CRP(mg/L)TNF-α(ng/L)IL-6(ng/L)對照組 治療前11.79±1.3729.53±4.1218.56±2.56 治療后8.02±1.12*20.78±3.47*13.79±1.78*觀察組 治療前12.23±1.3930.75±4.2420.21±2.64 治療后3.68±0.55*#12.58±1.95*#6.78±0.89*#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

3 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高和人口老齡化，DN的發病率逐年增加，對人類健康造成嚴重威脅。然而，DN的發病機制尚未完全闡明，許多學者認為DN發病與遺傳、環境、免疫等因素有關，具體表現為血糖升高、脂代謝紊亂、高血壓、胰島素抵抗、腎血流動力學異常，最終導致糖基化終產物增多、細胞外基質積聚、蛋白尿、腎小球硬化等癥狀體征。研究發現，炎性反應貫穿DN發生及進展的始末，且在T淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞參與下炎性反應不斷擴大形成惡性循環，造成腎臟局部病理變化不斷加重。此外，長期的炎性狀態也與DN患者發生心血管等并發癥密切相關。

研究證實，核因子кB(NF-κB)炎癥信號通路的激活是DN發生發展的重要病理機制[7]。靜息狀態下，NF-κB在細胞漿中以p50/p65二聚體形式存在，并與其抑制蛋白IκB結合形成無活性的三聚體。當機體炎性反應發生時，TNF-α和IL-1β激活IκB激酶復合物IKKs，后者被磷酸化、泛素化后降解，繼而三聚體p50/p65/IκB釋放p50/p65，p50/p65發生核轉位與相應靶基因上的κB位點結合啟動基因表達[8,9]。NF-κB可激活hs-CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子的轉錄和表達。hs-CRP、TNF-α、IL-6是機體重要的炎性介質，其表達水平隨著DN病情進展不斷升高，是反應疾病嚴重程度的可靠指標。hs-CRP、TNF-α、IL-6不僅直接損傷系膜細胞，還能誘導腎臟系膜細胞增殖并產生氧自由基，從而損傷細胞內膜和基底膜引起蛋白尿。此外，TNF-α和IL-1β還能誘導中性粒細胞、單核巨噬細胞產生趨化因子，進而產生更多炎性介質，后者又正反饋調節NF-κB的激活，從而引起炎性反應信號的放大和組織細胞持續性損傷。由此可見，DN患者長期處于一種炎性損害循環中，因此抑制NF-κB誘導的炎性反應的激活就成為DN治療的關鍵?；A和臨床研究均證實，利用藥物降低NF-κB、hs-CRP、TNF-α等炎性因子水平能夠對DN發揮腎臟保護作用[10,11]。

紅花黃色素是活血化瘀類中藥紅花的主要成分，主要含有羥基紅花黃色素A，具有通經、活血、止痛的功效?，F代藥理學研究表明，紅花黃色素具有擴張血管、抑制血小板聚集及血栓形成、增加局部血液灌注、改善微循環等作用，能夠從多靶點治療腎臟疾病[12,13]。動物實驗結果表明，紅花黃色素能夠減輕糖尿病大鼠腎間質纖維化，從而發揮腎臟保護作用[14]。高燕等[15,16]研究發現，紅花黃色素治療DN能夠降低患者炎性因子水平和蛋白尿，并改善胰島素抵抗，從而延緩DN進程，且無明顯不良反應。

本研究在二甲雙胍控制血糖基礎上加用紅花黃色素治療早期DN，結果顯示，觀察組總有效率較對照組明顯提高，并且與治療前比較，2組治療后NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達及hs-CRP、TNF-α、IL-6水平明顯降低，且觀察組上述指標降低程度優于對照組(P<0.05)，表明紅花黃色素聯合二甲雙胍能夠通過抑制NF-κB炎癥信號通路的激活和炎性因子的釋放發揮治療作用，與他人研究結果[17]一致。

綜上所述，NF-κB炎癥信號通路的異?；罨贒N發生發展中發揮重要作用。紅花黃色素聯合二甲雙胍治療早期DN能夠有效改善患者癥狀體征，延緩腎小球硬化及腎間質纖維化進程，效果優于單純二甲雙胍治療，其機制與抑制NF-κB炎癥信號通路的激活、糾正炎性因子失衡有關。以NF-κB炎癥信號通路為靶點對抑制DN患者炎性反應、減輕DN損害具有積極治療意義。但是，NF-κB如何在基因水平調控炎性因子的表達仍需進一步研究。

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3 You JJ,Yang CH,Yang CM,et al.Cyr61 induces the expression of monocyte chemoattractant protein-1 via the integrin ανβ3,FAK,PI3K/Akt,and NF-κB pathways in retinal vascular endothelial cells.Cell Signal,2014,26:133-140.

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15 高燕，袁魯亮，劉占全，等.紅花黃色素在早期糖尿病腎病中的應用價值.陜西醫學雜志，2015，44：298-299.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.11.017

075000 河北省張家口市第一醫院內分泌科(鮑喜靜、彭一、董陸玲、唐宏霞、楊秀紅、王新婷、辛麗娟、張翠靜、吳嘉鳴)，重癥監護科(李建英)

R 587.24

A

1002-7386(2017)11-1664-03

2016-11-08)