葉片疊加導(dǎo)致熒光產(chǎn)量增加的原因分析

黃語(yǔ)琦

研究背景

葉綠素色素分子未激發(fā)時(shí)處于能量的最低狀態(tài)——基態(tài)。色素分子吸收1個(gè)光子后，會(huì)引起原子結(jié)構(gòu)內(nèi)電子的重新排列。其中一個(gè)低能的電子獲得能量后就可克服原子核正電荷對(duì)其的吸引力而被推進(jìn)到高能的激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的葉綠素分子回至基態(tài)時(shí)，能夠以光子形式釋放能量。處在激發(fā)態(tài)（第一單線態(tài)）的葉綠素分子回至基態(tài)時(shí)發(fā)出的光稱為熒光（fluorescence）。葉綠素?zé)晒馐茄芯抗夂献饔霉夥磻?yīng)中光能吸收、捕獲、利用和分配極為重要的工具。其在抗逆研究、品種評(píng)價(jià)和篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)等方面起著重要作用。

近期，有臺(tái)灣學(xué)者認(rèn)為目前對(duì)于葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)定和分析方法忽略了葉片的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，這種方法存在一定缺陷。他們認(rèn)為他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了激發(fā)光能夠到達(dá)第2層葉片，并以弱光的形式激發(fā)下層葉片的熒光。而且，他們還初步證明J-I這一段熒光產(chǎn)量的增加很可能與深層細(xì)胞激發(fā)的熒光有關(guān)。

研究過(guò)程

葉片疊加后熒光產(chǎn)量的增加是否完全由第2個(gè)葉片受激發(fā)而產(chǎn)生？熒光產(chǎn)量增加的原因究竟是什么？此外，激發(fā)光強(qiáng)度是否影響對(duì)熒光結(jié)果的分析？本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行了探究，用葉片疊加的方法進(jìn)行熒光產(chǎn)量的測(cè)定，目的是驗(yàn)證臺(tái)灣學(xué)者葉片疊加方法的可行性與效果，并提出改進(jìn)思路，探究熒光產(chǎn)量增加的可能原因。

葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的驗(yàn)證

本次實(shí)驗(yàn)選擇了成熟新鮮的元寶楓葉片作為實(shí)驗(yàn)材料（見(jiàn)圖1）。設(shè)定激發(fā)光光強(qiáng)梯度為由弱光到強(qiáng)光200～3 000umol ms，每200umol ms一個(gè)激發(fā)光梯度。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可觀察到，葉片疊加的確可以導(dǎo)致測(cè)得的Fn、FJ、F1、FP熒光產(chǎn)量均增加；激發(fā)光較弱時(shí)增加幅度小，伴隨激發(fā)光的增強(qiáng)，各特征點(diǎn)熒光產(chǎn)量也迅速增加。與之前臺(tái)灣學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

激發(fā)光穿透葉片后的強(qiáng)度測(cè)定

為了研究葉片疊加后熒光產(chǎn)量的增加是否與第2層葉片中葉綠素的激發(fā)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)量了激發(fā)光在透過(guò)第1層葉片且被其中葉綠素吸收后的強(qiáng)度。光強(qiáng)使用光量子計(jì)測(cè)定。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看出，激發(fā)光在穿過(guò)第1層葉片被其中葉綠素吸收后，光強(qiáng)大大減弱，比本實(shí)驗(yàn)中最低激發(fā)光200 umolm s還要小。因此透射光激發(fā)的第2層葉片的熒光對(duì)熒光產(chǎn)量貢獻(xiàn)很小。

平面鏡模擬葉片對(duì)熒光反射的研究

倘若穿過(guò)第1層葉片后的激發(fā)光強(qiáng)度不足以激發(fā)第2層葉片，那么葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的原因是什么？我推測(cè)，這可能與葉片上表面的蠟質(zhì)對(duì)熒光的反射作用有關(guān)。葉片的角質(zhì)層常分2層，其中細(xì)胞壁外面是一層較薄的、由角質(zhì)或角質(zhì)與蠟質(zhì)混合組成的角質(zhì)層。

蠟質(zhì)的存在導(dǎo)致了上層葉片被激發(fā)光激發(fā)的熒光向四面?zhèn)鬟f，一部分到達(dá)下層葉片被下層葉表面的蠟質(zhì)反射上去。最終被葉片上方的熒光探頭接收到，導(dǎo)致了測(cè)得的熒光產(chǎn)量增加，見(jiàn)圖2。

為了繼續(xù)研究葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的原因，驗(yàn)證下層葉片的反射是否會(huì)導(dǎo)致測(cè)得的熒光產(chǎn)量增加，實(shí)驗(yàn)中選用了平面鏡作為實(shí)驗(yàn)材料。平面鏡對(duì)熒光有很好的反射作用，且不會(huì)產(chǎn)生新的熒光，可以用來(lái)替代下層葉片研究熒光的反射。

實(shí)驗(yàn)材料分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為單層葉片、單層葉片疊加平面鏡、雙層葉片疊加。測(cè)量單層葉片疊加平面鏡時(shí)，將平面鏡疊加在元寶楓葉片的下層，和疊加2層葉片的方法相同，用葉綠素?zé)晒鉁y(cè)試儀在葉片上方測(cè)量熒光產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得單層、單層疊加葉片、雙層3組的O、J、I、P 4個(gè)熒光特征點(diǎn)的熒光產(chǎn)量，其中F0實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。將疊加葉片與疊加平面鏡后熒光產(chǎn)量的增長(zhǎng)率相減，能大致得出排除葉表反射后，第2層葉片真實(shí)激發(fā)的熒光比例。

由數(shù)據(jù)可以看出，在葉片下層疊加平面鏡后的確使測(cè)得的熒光產(chǎn)量增加了。這證明反射作用能使熒光產(chǎn)量增加。這一部分熒光產(chǎn)量的增加是來(lái)自于葉表面的蠟質(zhì)/角質(zhì)層的反射所致。

我們的結(jié)果也證明2層葉片疊加的熒光產(chǎn)量大于1層葉片疊加平面鏡的熒光產(chǎn)量。單獨(dú)疊加平面鏡，各特征點(diǎn)F0、FI、FJ、FP熒光產(chǎn)量增加均在10%以下，疊加葉片熒光產(chǎn)量的增加則在20%左右。說(shuō)明葉片疊加條件下熒光產(chǎn)量的增加與第2層葉片葉表的熒光反射和葉綠素的激發(fā)均有關(guān)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中疊加葉片與疊加平面鏡后熒光產(chǎn)量的增長(zhǎng)率差，能大致得出排除葉表反射后，第2層葉片真實(shí)激發(fā)的熒光比例，各激發(fā)光強(qiáng)下，各特征點(diǎn)F0、FI、FJ、FP平均值約為6.98%、11.26%、9.49%和7.78%。增加比例約為10%。

結(jié)論

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們證明了：

疊加后增加的熒光產(chǎn)量一部分來(lái)自于第2層葉表對(duì)第1層葉片激發(fā)熒光的反射，還有一部分來(lái)自于第2層葉片自身的激發(fā)。

在200～3000umolm s激發(fā)光強(qiáng)下，隨激發(fā)光強(qiáng)的增加，熒光產(chǎn)量增長(zhǎng)幅度逐漸增大，增長(zhǎng)率保持在20%。葉表面反射與第2層葉片的激發(fā)分別占熒光產(chǎn)量的10%左右。

臺(tái)灣學(xué)者的葉片疊加實(shí)驗(yàn)存在一些問(wèn)題，即沒(méi)有考慮葉表面（蠟質(zhì)）對(duì)熒光的反射。因此他得出的結(jié)果尚不夠完善。

本次實(shí)驗(yàn)證明了葉片結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞層數(shù)、葉表蠟質(zhì)對(duì)葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量存在的影響。因此日后在運(yùn)用葉綠素?zé)晒獾臄?shù)學(xué)模擬方法分析不同種類葉片淺表的光能吸收、捕獲和分配，以研究葉片的光合作用時(shí)，需得考慮葉片結(jié)構(gòu)的不同點(diǎn)，如葉片厚度、細(xì)胞層數(shù)、葉表蠟質(zhì)厚度等。

展望

本次實(shí)驗(yàn)分析探究了葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的原因，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)研究葉面反射、下層葉片細(xì)胞乃至深層細(xì)胞激發(fā)占增加熒光產(chǎn)量的精確比例，也可以選擇不同葉片厚度、不同葉表蠟質(zhì)厚度的葉片進(jìn)一步證明葉片結(jié)構(gòu)對(duì)熒光產(chǎn)量的影響。

本次實(shí)驗(yàn)可以推動(dòng)熒光理論的發(fā)展，應(yīng)用到對(duì)熒光測(cè)定和分析技術(shù)的完善，以及對(duì)熒光儀的改進(jìn)之中，為植物光合作用和抗逆研究提供重要實(shí)驗(yàn)支持。