新型siRNA抗流感病毒活性的研究

張永欣，趙斐，王宇佳，張瑞欣，岑山

新型siRNA抗流感病毒活性的研究

張永欣*，趙斐*，王宇佳，張瑞欣，岑山

目的設(shè)計(jì)合成具有廣譜性抗流感病毒活性的 siRNA，分別在細(xì)胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)進(jìn)行活性評價(jià)。

方法從甲型流感病毒毒株 A/WSN/33 的基因（PB2、PB1、PA、M、NS）中提取高度保守的序列設(shè)計(jì)合成 siRNA。通過 293T-Gluc 系統(tǒng)和單輪感染流感病毒系統(tǒng)對 siRNA 進(jìn)行活性篩選。然后在細(xì)胞水平檢測 siRNA 對流感病毒復(fù)制的抑制作用，并且經(jīng)霧化給藥途徑對 siRNA 的體內(nèi)抗流感活性進(jìn)行評價(jià)。

結(jié)果活性篩選得到 4 條具有 50% 以上抑制活性的siRNA（siPB2-1、siPB2-2、siPB1-2 和 siNS-1），EC50值在0.4 ～ 1.3 nmol/L 之間。4 條 siRNA 對另外兩株 A/PR/8/34和 B/Beijinghaidian/1386/2013（Victoria 系）流感病毒均表現(xiàn)出較好的抑制活性。動物實(shí)驗(yàn)表明，siPB2-1 經(jīng)霧化給藥途徑可以對流感病毒感染的小鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

結(jié)論新合成的 siRNA 在細(xì)胞水平和小鼠體內(nèi)均具有良好的抗流感病毒活性。

流感病毒，A 型； RNA，小分子干擾； 動物實(shí)驗(yàn)

流感病毒是引起人類急性呼吸道傳染病最主要的病原，主要通過空氣飛沫傳播，具有傳播速度快、發(fā)病率高和常伴有嚴(yán)重并發(fā)癥等特點(diǎn)。流感每年在溫帶的秋冬季節(jié)大量流行，造成相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)估計(jì)，全世界每年會有 25 萬 ～ 50 萬人因此喪生[1]。流感病毒可以在不同宿主之間直接或間接傳播，易發(fā)生基因重配產(chǎn)生新的亞型，從而帶來災(zāi)難性的后果。如人類歷史上的幾次流感大爆發(fā)，已導(dǎo)致全球數(shù)百萬人喪生。而 2013 年在我國出現(xiàn)的 H7N9 禽流感病毒更是以相當(dāng)高的死亡率再次引起人們對流感病毒的高度關(guān)注。

流感病毒屬于正黏病毒科，分為甲、乙、丙三型。其中甲型流感病毒危害最大，至今為止的流感大流行都是由甲型流感病毒引發(fā)。甲型流感病毒的基因組由 8 條單股負(fù)鏈 RNA 組成，在病毒自身編碼的 RNA 聚合酶和宿主因子的共同作用下轉(zhuǎn)錄形成互補(bǔ)的正鏈 mRNA，共編碼 10 種病毒蛋白。其中 PB2、PB1 和 PA 三個(gè)蛋白組成流感病毒的 RNA 聚合酶（RdRP），負(fù)責(zé)催化病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[2]。M 基因編碼 M1 和 M2 兩種蛋白，流感病毒進(jìn)入細(xì)胞后，H+經(jīng)由 M2 離子通道進(jìn)入病毒顆粒內(nèi)部，引起病毒脫衣殼，進(jìn)而病毒基因組（vRNPs）從 M1 蛋白上解離并釋放到胞質(zhì)中。NS 基因也編碼兩種蛋白，即非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1 和NS2。NS1 蛋白可以調(diào)節(jié)病毒 RNA 的合成、剪切及 mRNA 的翻譯過程[3]。NS2 蛋白通過與 M1 蛋白作用，負(fù)責(zé)將 vRNPs 從核內(nèi)輸送到胞漿。這些結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在流感病毒的復(fù)制周期中發(fā)揮重要作用。

目前流感的防治主要依靠藥物和疫苗。常見的藥物有 M2 離子通道阻斷劑（金剛烷胺、金剛乙胺等）和 NA 抑制劑（扎那米韋、奧司他韋等）[4]，以及一些其他的新型藥物。流感疫苗主要有三種類型：滅活疫苗、減毒活疫苗和 DNA 疫苗。但是由于藥物頻發(fā)的耐藥性[5-6]以及疫苗作用的局限性，使得藥物和疫苗的研發(fā)成了一個(gè)永無止境的過程。因此，探尋一種新型、有效的流感防治方法迫在眉睫。

RNA 干擾（RNAi）技術(shù)，作為一種新型的生物技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于基因功能探索以及傳染性疾病和惡性腫瘤的防治，同時(shí)在抗病毒研究領(lǐng)域也表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢[7]。RNAi 作用通過一類較穩(wěn)定的作用分子實(shí)現(xiàn)，主要包括小干擾 RNA（siRNAs）、核糖核酸酶 Dicer、RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）[8]。siRNA 是大小 21 ～ 25 nt 的雙鏈RNA 分子。RnaseIII 型核酸酶 Dicer 具有解旋酶活性，含有 dsRNA 結(jié)合區(qū)，可將細(xì)胞中的 dsRNA裂解為 siRNAs[9]。RISC 包含 Dcr-2 蛋白、R2D2蛋白以及 Argonaute 蛋白。研究表明，Argonaute 家族蛋白具有 RNA 內(nèi)切酶活性，能夠降解與 siRNA互補(bǔ)的 mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)[10]。

與藥物和疫苗作用于蛋白不同，RNAi 通過向細(xì)胞中導(dǎo)入與病毒 mRNA 編碼區(qū)同源的短雙鏈siRNA 使該 mRNA 發(fā)生降解，從而沉默病毒基因的表達(dá)。目前 RNAi 技術(shù)在抗流感中的應(yīng)用主要包括兩個(gè)方面：一方面是尋求有效的針對病毒蛋白基因的 siRNA，從而阻斷流感病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制；另一方面則是通過 RNAi 技術(shù)沉默宿主靶蛋白的表達(dá)，從而篩選出與流感病毒復(fù)制相關(guān)的宿主因子。2003 年，Ge 等[11]發(fā)現(xiàn)，用靶向 NP（1496-1514）或者 PA（2087-2106）的特異性 siRNA 處理MDCK 細(xì)胞后再感染流感病毒，兩條 siRNAs 均能阻斷病毒的復(fù)制。進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些 siRNAs 能夠在小鼠體內(nèi)減弱流感病毒的致病性，并且對其他高致病性毒株同樣具有抑制作用[12-13]。

由于傳統(tǒng)抗流感治療的局限性，RNAi 已經(jīng)逐漸成為一種新興的抗流感病毒手段。本文中，我們自主設(shè)計(jì)了 10 條全新序列的 siRNA，并在動物實(shí)驗(yàn)中嘗試了霧化給藥的方式，為促進(jìn) siRNA 抗流感病毒的應(yīng)用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和動物 動物犬腎上皮細(xì)胞（MDCK）獲贈于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所；人胚腎上皮細(xì)胞 293T、293T 衍生細(xì)胞系293T-Gluc 克隆 6、A549 衍生細(xì)胞系 A549-5ps克隆 10 均為本室自有；BALB/c 小鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 質(zhì)粒 質(zhì)粒和 siRNA 甲型流感病毒（IAV）8 質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng) pHW181-PB2、pHW182-PB1、pHW183-PA、pHW184-HA、pHW185-NP、pHW186-NA、pHW187-M、pHW188-NS 獲贈于美國圣裘德兒童研究醫(yī)院的Robert G Webster 博士；siRNA 序列由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要試劑 Gaussia 熒光素酶（Gluc）底物腔腸素 h（coelenterazine-h）購自美國 Promega 公司；TPCK 處理的胰蛋白酶、氨芐青霉素（Amp）、Tween-20、TEMED 購自美國 Sigma-Aldrich 公司；殺稻瘟菌素（Bsd）、蛋白分子量 marker PageRulerTMplus prestained protein ladder 購自美國 Life Technologies 公司；Flu-NP 鼠單克隆抗體（貨號：SC-101352）、β-actin 鼠單克隆抗體（貨號：SC-47778）購自美國 Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG 二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA 裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。DNA 片段回收和純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；質(zhì)粒大提試劑盒 Hi-speed plasmid maxi kit 購自德國 Qiagen公司。

1.1.4 儀器 Centro XS3LB 960 酶標(biāo)儀購自德國Berthold 公司；Victor X5 多功能酶標(biāo)儀購自美國PerkinElmer 公司；Molecular imager Gel DocTMXR凝膠成像儀、MJ MiniTMGradient Thermal Cycler PCR 儀購自美國 Bio-Rad 公司；Nanodrop 2000分光光度計(jì)購自美國 Thermo Scientific 公司；小鼠霧化給藥裝置購自上海晟廷生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA 的設(shè)計(jì) 我們通過比對甲型流感病毒毒株 A/WSN/33 的基因序列（PB2、PB1、PA、M、NS），從頭逐個(gè)提取符合 siRNA 設(shè)計(jì)要求的片段，并且 BLAST 確定片段的同源性，從中選擇在不同型別的流感毒株中高度保守的序列。排除文獻(xiàn)已報(bào)道的 siRNA 序列后，最終選取了 10 條siRNA 進(jìn)行抗流感活性的檢測。新設(shè)計(jì)的各條siRNA 序列詳見表 1，序列名稱表示該條 siRNA靶向的病毒基因。

表 1 siRNA 序列Table 1 siRNA sequences

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及 siRNA 轉(zhuǎn)染 293T、293T-Gluc、MDCK 和 A549-5ps 細(xì)胞均培養(yǎng)于含10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養(yǎng)基中。其中293T-Gluc 和 A549-5ps 的培養(yǎng)基中需要加入終濃度為 10 μg/ml 的 Bsd。細(xì)胞維持液為含 2% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基。將 293T-Gluc 細(xì)胞接種于 6 孔板中，每孔接種 4 × 105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞接種 12 h 后使用 Lipofectamine RNAi Max 轉(zhuǎn)染siRNA，12 h 后進(jìn)行二次轉(zhuǎn)染，在初次轉(zhuǎn)染后 24 h接種流感病毒。

1.2.3 流感病毒的制備 在直徑為 10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中以 3∶1 比例接種 1.8 × 106個(gè) 293T細(xì)胞和 0.6 × 106個(gè) MDCK 細(xì)胞。培養(yǎng) 24 h 后，使用 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染流感病毒 8 質(zhì)粒，每種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量為 1.2 μg。轉(zhuǎn)染后 6 h，將培養(yǎng)液更換為新鮮的 DMEM 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后 24 h 在培養(yǎng)基中加入終濃度為 1 μg/ml 的 TPCK-trypsin。培養(yǎng) 48 h 后收上清，1000 r/min 離心 5 min 去掉細(xì)胞碎片，上清用 0.45 μm 濾膜過濾，分裝成小份，保存于 –80 ℃ 冰箱。

1.2.4 流感病毒滴度（TCID50）測定 參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行檢測。將 MDCK 細(xì)胞接種到96 孔板，每孔接種 104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng) 24 h 細(xì)胞長成單層后，吸出上清，用 PBS 清洗 2 遍，每孔加入 100 μl 用維持液 10 倍系列稀釋的病毒稀釋液；同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照組（只加 100 μl 維持液）。置于 35 ℃ 孵箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）并記錄結(jié)果，一般于 3 ～ 5 d 后終止觀察，按照 Reed-Muench 兩氏法計(jì)算病毒的滴度。

1.2.5 Western blot 檢測 收集 6 孔板中的細(xì)胞，加入 RIPA 裂解液在冰上裂解 30 min 后，于4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，收集上清制備細(xì)胞裂解液蛋白樣品。樣品經(jīng) 10% SDS-PAGE 分離后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉和抗體孵育。抗體的使用濃度分別為：Flu-NP（1∶5000）、β-actin（1∶5000）、山羊抗小鼠二抗（1∶5000）。最后用 ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯色。

1.2.6 Gluc 活性檢測 Gluc 活性檢測依照Tannous[15]提供的方法操作。首先，在 PBS 溶液中溶解腔腸素 h，配制濃度為 16.7 μmol/L 的底物工作液，室溫避光孵育 30 min。取 10 μl 待測上清到白色不透明 96 孔板中，使用酶標(biāo)儀自動進(jìn)樣器將避光孵育的底物工作液按每孔 60 μl 的進(jìn)樣量逐孔加入，持續(xù)收集信號 0.5 s，測量結(jié)果以相對光單位（RLU）表示。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 根據(jù) Invitrogen 公司的 TRIzol 使用說明書，提取細(xì)胞總 RNA。使用一步法熒光定量 PCR 反應(yīng)試劑盒以管家基因gapdh 為內(nèi)參，用 2－ΔΔCt法對待測基因 mRNA 水平進(jìn)行相對定量。RT-PCR 引物序列如表 2 所示。反應(yīng)條件為：42 ℃ 逆轉(zhuǎn)錄 5 min；95 ℃，10 s；95 ℃，5 s 和 60 ℃，34 s；共 40 次循環(huán)。

1.2.8 siRNA 抗病毒活性檢測 應(yīng)用 293T-Gluc細(xì)胞系對 siRNA 抗流感病毒活性進(jìn)行初步篩選。流感病毒感染 293T-Gluc 細(xì)胞后能夠特異性啟動分泌型 Gluc 的表達(dá)，從而可以通過檢測上清中Gluc 蛋白的活性來測定病毒的感染性。接種293T-Gluc 細(xì)胞于 6 孔板中，每孔接種 6 × 105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞接種 24 h 后使用 Lipofectamine RNAi MAX 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染終濃度為 30 nmol/L 的siRNA 進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 12 h 后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。二次轉(zhuǎn)染 siRNA 后 12 h 感染流感病毒（MOI = 2.5），細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后取上清液檢測 Gluc蛋白活性。

表 2 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 引物序列Table 2 Primer sequences for real-time RT-PCR

應(yīng)用單輪感染流感病毒對 siRNA 的抗流感病毒活性進(jìn)行復(fù)篩。單輪感染流感病毒是將野生型WSN 株流感病毒的 HA 基因編碼序列替換為Gluc 報(bào)告基因的編碼序列，只能進(jìn)行單輪復(fù)制的流感假病毒。細(xì)胞上清中 Gluc 的活性可以間接反映病毒的增殖活性，從而能夠用于抗病毒活性的篩選。接種 293T 細(xì)胞于 6 孔板中，每孔接種 6 × 105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞接種 24 h 后按照上述方法轉(zhuǎn)染siRNA 進(jìn)入細(xì)胞。二次轉(zhuǎn)染 siRNA 后 12 h 感染單輪流感病毒（MOI = 0.5），細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 12 h 后取上清液檢測 Gluc 蛋白活性。

1.2.9 siRNA EC50測定 接種 293T-Gluc mono6細(xì)胞于 24 孔板，每孔接種 1 × 105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞接種 24 h 后使用 Lipofectamine RNAi MAX 轉(zhuǎn)染不同濃度梯度的 siRNA 進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 12 h 后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。二次轉(zhuǎn)染后 12 h 感染流感病毒（MOI = 2.5），細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后取上清液檢測 Gluc 蛋白活性。

1.2.10 空斑實(shí)驗(yàn) 接種 MDCK 細(xì)胞于 12 孔板，每孔接種 3 × 105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞接種后 24 h，吸棄培養(yǎng)基上清，用 PBS 清洗細(xì)胞 2 ～ 3 次。每孔加入 400 μl 用 DMEM 培養(yǎng)基稀釋的病毒液，每個(gè)稀釋度設(shè) 2 個(gè)復(fù)孔，置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附 2 h。吸附完成后吸去上清，用 37 ℃ 預(yù)熱的 PBS 清洗 1 次，每孔加入 1 ml 含有 0.3% BSA 和 1.5 μg/ml TPCK-trypsin 的 1% 低熔點(diǎn)瓊脂。待瓊脂層凝固后，將細(xì)胞板倒置于 35 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 ～ 4 d。當(dāng)有肉眼可見的白色斑點(diǎn)出現(xiàn)后，每孔加入 1 ml 濃度為 0.16 mg/ml 的中性紅溶液進(jìn)行染色，37 ℃ 避光作用 4 h 后吸去染液，計(jì)數(shù)空斑。

1.2.11 siRNA 小鼠體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn) 取三組4 ～ 5 周齡的 BALB/c 小鼠，每組 10 只。每只小鼠分兩次霧化給入 1 nmol 的脂質(zhì)體包裹的 siRNA（siPB2-1），陰性對照組霧化給入相同劑量的脂質(zhì)體包裹的對照 siRNA（siNC）或相同體積的 PBS。兩次霧化給入 siRNA 的時(shí)間間隔為 24 h，然后每只小鼠滴鼻接種 40 μl 滴度為 7 lgTCID50/ml 的WSN 株流感病毒，連續(xù)觀察并記錄小鼠的存活率和體重變化情況。

圖 1 siNC 的驗(yàn)證（A549-5ps 細(xì)胞二次轉(zhuǎn)染 siRNA 后60 h 換液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后收集上清檢測 Gluc 蛋白活性）Figure 1 Validation of negative control siNC (The supernatants were replaced 60 h after second round transfection of siRNA into A549-5ps cells, and then the activity of Gluc in the supernatants was measured after 24 h cultivation)

圖 2 siRNA 抗流感活性的初步篩選（293T-Gluc 細(xì)胞二次轉(zhuǎn)染 siRNA 后 24 h接種甲型流感病毒，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后收集上清檢測 Gluc 蛋白活性）Figure 2 Preliminary validation of siRNA anti-influenza virus activity (293T-Gluc cells were inoculated with IAV 24 h after second round transfection of siRNA, and then the activity of Gluc in the supernatants was measured after 24 h cultivation)

2 結(jié)果

2.1 陰性對照 siRNA 的驗(yàn)證

首先借助實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的 A549-5ps 細(xì)胞系驗(yàn)證陰性對照 siRNA 的可靠性，保證其不會對后續(xù)的活性檢測工作產(chǎn)生干擾。A549-5ps 細(xì)胞系可以模擬流感病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制系統(tǒng)，表達(dá)依賴病毒RNA 聚合酶特異性啟動的分泌型 Gluc 蛋白。首先通過 RT-PCR 檢測證實(shí)了該細(xì)胞系中 PB2、PB1、PA 以及 NP 蛋白 mRNA 水平的表達(dá)及模擬的 vRNA 的存在。由于 A549-5ps 細(xì)胞系中不存在 M 和 NS 蛋白的 mRNA，那么陰性對照siRNA 和靶向 M 和 NS 基因的 siRNA 都不會對 Gluc 信號產(chǎn)生明顯的影響。圖 1 結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了 siNC、siM 和 siNS 的實(shí)驗(yàn)組中，Gluc信號沒有明顯的差異，證明實(shí)驗(yàn)中所使用的陰性對照 siNC 不會對驗(yàn)證工作產(chǎn)生干擾。

2.2 siRNA 抗流感病毒活性的初步篩選

我們借助實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的 293T-Gluc 細(xì)胞系對 siRNA 在細(xì)胞水平上的抗流感病毒活性進(jìn)行初步篩選。流感病毒感染 293T-Gluc 細(xì)胞后能夠特異性啟動分泌型 Gluc 的表達(dá)，從而可以通過檢測上清中 Gluc 蛋白的活性來測定病毒的感染性。通過2 次轉(zhuǎn)染的方式對新合成的 10 條 siRNA 的抗病毒作用進(jìn)行了初步檢測（圖 2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中7 條 siRNA 具有 50% 左右的抗病毒活性。

2.3 siRNA 抗流感病毒活性的二次篩選

為了避免初次篩選過程中出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，我們又借助單輪感染流感病毒系統(tǒng)在 293T 細(xì)胞中對 siRNA 的抗流感活性進(jìn)行了再次驗(yàn)證（圖 3）。單輪感染流感病毒是一種帶有 Gluc 報(bào)告系統(tǒng)的只能進(jìn)行單輪復(fù)制的流感假病毒，其基因組的 HA基因被 Gluc 序列替代，可以用來進(jìn)行抗流感活性篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初步篩選得到的 7 條 siRNA 中，只有 4 條 siRNA 抑制病毒的活性達(dá)到 50% 以上。最終，我們選取了 siPB2-1、siPB2-2、siPB1-2和 siNS-1 這 4 條 siRNA 進(jìn)行下一步的驗(yàn)證工作。

2.4 siRNA 在 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平對流感病毒的抑制作用

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染進(jìn)入 293T 細(xì)胞的 siRNA 抑制流感病毒復(fù)制的作用，我們分別收集樣品進(jìn)行病毒mRNA 水平和蛋白水平的檢測。對于不同的siRNA，我們統(tǒng)一采用了流感病毒標(biāo)志性的 NP 基因作為檢測對象。免疫印跡（圖 4A）和qRT-PCR（圖 4B）結(jié)果顯示，在分別轉(zhuǎn)染了 4 條 siRNA 的實(shí)驗(yàn)組中，NP 蛋白的表達(dá)量和 mRNA 水平與陰性對照組相比都有明顯的降低，抑制轉(zhuǎn)錄活性均達(dá)60% 以上。這一結(jié)果與之前的篩選結(jié)果相吻合，證明我們設(shè)計(jì)合成的 siRNA 可以在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平有效地抑制流感病毒的復(fù)制。

圖 3 siRNA 抗流感活性的二次篩選（293T 細(xì)胞二次轉(zhuǎn)染siRNA 后 24 h 接種單輪感染流感病毒，繼續(xù)培養(yǎng) 12 h 后收集上清檢測 Gluc 蛋白活性）Figure 3 Re-validation of siRNA anti-virus activity (293T cells were inoculated with single-cycle infectious influenza virus 24 h after second round transfection of siRNA, and then the activity of Gluc in the supernatants was measured after 12 h cultivation)

圖 4 siRNA 在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對流感病毒的抑制作用（A：免疫印跡檢測 NP 蛋白的表達(dá)；B：qRT-PCR 檢測 NP 蛋白的 mRNA 水平）Figure 4 Inhibitory effect of siRNA on IAV at both transcription and translation level (A: Detection of NP protein by Western blot; B: Detection of NP mRNA by qRT-PCR)

2.5 siRNA EC50測定

在明確了 siRNA 的抗流感病毒活性后，為了評估新設(shè)計(jì)的 siRNA 是否具有成藥的潛力，我們通過測定不同濃度梯度 siRNA 的抑制活性，借助Graphpad Prism5 軟件對 4 條 siRNA 的 EC50值進(jìn)行了計(jì)算和評估（圖 5）。4 條 siRNA 的 EC50值在 0.4 ～ 1.3 nmol/L 之間，與已發(fā)表的 siRNA 序列相比，我們自行設(shè)計(jì)的 siRNA 具有更好的抗病毒活性。

2.6 siRNA 對不同流感毒株的抑制作用

siRNA 在最初設(shè)計(jì)時(shí)選擇了高度保守的區(qū)域，以期能夠?qū)Χ喾N流感毒株都有抑制作用。為了驗(yàn)證siRNA 是否具有廣譜的抗流感病毒作用，我們通過空斑實(shí)驗(yàn)，分別對 A/PR/8/34 和 B/Beijinghaidian/ 1386/2013（Victoria 系）兩株流感病毒進(jìn)行了siRNA 抑制活性的檢測。圖 6 顯示 4 條 siRNA對兩種不同型別的流感病毒均具有一定的抑制作用，其中對 A/PR/8/34 株的抑制作用較強(qiáng)，抑制活性達(dá) 70% 以上，說明新設(shè)計(jì)的 siRNA 具有廣譜的抗流感病毒作用。

2.7 siRNA 小鼠體內(nèi)抗流感病毒活性的初步觀察

為了明確 siRNA 是否在動物體內(nèi)也具有抗流感病毒活性，我們選取了其中抗流感活性較高的一條 siRNA（siPB2-1）進(jìn)行體內(nèi)活性的檢測。取三組 4 ～ 5 周齡的 BALB/c 小鼠，經(jīng)霧化給藥途徑，分別給入脂質(zhì)體包裹的 PBS、siPB2-1 和 siNC。二次霧化給入 siRNA 后每只小鼠滴鼻接種 WSN株流感病毒并觀察記錄小鼠的存活率和體重變化情況（圖 7）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，霧化給入 siPB2-1 的實(shí)驗(yàn)組與 PBS 及 siNC 的對照組相比，流感病毒感染小鼠的存活率明顯升高（66.7%），小鼠體重的變化也呈相對平穩(wěn)的趨勢，證明 siPB2-1 在動物體內(nèi)具有一定的抗流感活性，可以作為預(yù)防給藥抵抗流感病毒的侵襲。

圖 5 siRNA EC50測定（分別向 293T-Gluc 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同濃度的 siRNA，二次轉(zhuǎn)染后 24 h 接種流感病毒，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后收集上清檢測 Gluc 蛋白活性）（A：PB2-1，EC50= 0.69 nmol/L；B：PB2-2，EC50= 0.4 nmol/L；C：PB1-2，EC50= 0.88 nmol/L；D：NS-1，EC50= 1.3 nmol/L）Figure 5 EC50measurement of siRNAs (293T-Gluc cells were transfected with different concentrations of siRNA. 24 h after second round transfection of siRNA, cells were inoculated with IAV and then the activity of Gluc in the supernatants was measured after 24 h cultivation) (A: PB2-1, EC50= 0.69 nmol/L; B: PB2-2, EC50= 0.4 nmol/L; C: PB1-2, EC50= 0.88 nmol/L; D: NS-1, EC50= 1.3 nmol/L)

圖 6 siRNA 對不同流感毒株的抑制作用（A：A/PR/8/34 株；B：B/Beijinghaidian/1386/2013）Figure 6 Inhibitory effect of siRNAs on other influenza virus strains (A: A/PR/8/34 strain; B: B/Beijinghaidian/1386/2013 strain)

3 討論

RNAi 是在研究秀麗新小桿線蟲反義 RNA 的過程中被發(fā)現(xiàn)的，為雙鏈 RNA（dsRNA）介導(dǎo)的同源 RNA 降解過程[16]。此后，dsRNA 介導(dǎo)的 RNAi現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、錐蟲、水螅、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中，并證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、共抑制及 RNA 介導(dǎo)的病毒抗性、真菌的抑制現(xiàn)象均屬于 RNAi 在不同物種的表現(xiàn)形式。

圖 7 siRNA 小鼠體內(nèi)抗流感病毒活性（A：小鼠存活率；B：小鼠相對體重變化，死亡小鼠體重記為零）Figure 7 The anti-virus activity of siRNA in vivo (A: Survival rate of IAV-infected mice; B: Relative weight of mice)

2001 年，Bitko 和 Barik[17]利用合成的 siRNA成功抑制了呼吸道合胞病毒的增殖，首次證明了合成的 siRNA 具有抗病毒作用。隨后 siRNA 治療在抗流感病毒的研究中逐漸興起。除了 Ge 等[11]最初發(fā)現(xiàn)的 NP（1496-1514）和 PA（2087-2106）之外，還有靶向流感病毒其他蛋白的 PB1（1632-1652）[18]，PA（ps-PA496）[19]，M2、（psM-950）[20]和 M（331-351）[21]等。但是隨著流感病毒的不斷變異以及高致病性禽流感的出現(xiàn)，已知的 siRNA 已經(jīng)無法滿足人們防治流感病毒的需求。因此，我們旨在借助小分子 RNA 干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)合成新型的抗流感病毒 siRNA，以期能夠應(yīng)對日益嚴(yán)峻的高致病性流感疫情。

在本研究中，我們設(shè)計(jì)了 10 條新型 siRNA序列，并從中篩選到 4 條具有 50% 以上抑制活性的序列，其 EC50值在 0.4 ～ 1.3 nmol/L 之間。4 條 siRNA 對另外兩株 A/PR/8/34 和B/Beijinghaidian/1386/2013（Victoria 系）流感病毒均表現(xiàn)出較好的抑制活性。動物實(shí)驗(yàn)也表明，siPB2-1 經(jīng)霧化給藥途徑可以對流感病毒感染的小鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。與已報(bào)道的抗流感 siRNA序列相比，這些 siRNA 具有以下優(yōu)點(diǎn)：①自主設(shè)計(jì)：從流感病毒基因組（PB2、PB1、PA、M、NS）所有符合 siRNA 設(shè)計(jì)要求的序列中進(jìn)行篩選，從中選擇了未報(bào)道，高度匹配，高度保守的序列；②成本低：EC50的測定結(jié)果和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的用量小于文獻(xiàn)報(bào)道，作為潛在的抗流感病毒藥物可以降低使用成本；③適用范圍廣：不僅針對 A 型流感病毒，對于 B 型流感病毒同樣具有抑制作用，其靶向的流感病毒 RNA 聚合酶基因（PB2-1、PB2-2、PB1-2）變異率低，保守度較高，在流感大爆發(fā)的時(shí)候，可以作為一種廣譜的預(yù)防和治療藥物；④可靠性高：該 siRNA 未采用任何修飾，避免了siRNA 在給藥過程中出現(xiàn)的不兼容問題。

采用 siRNA 抗流感較常規(guī)的藥物研發(fā)有明顯的優(yōu)勢。例如，siRNA 的設(shè)計(jì)僅需依據(jù)病毒基因序列，在季節(jié)性流感爆發(fā)時(shí)，可以根據(jù)流行株的基因序列，迅速大量地合成 siRNA。同時(shí)，可以針對同一毒株的不同靶點(diǎn)合成多條 siRNA 實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)抗病毒治療。目前的 siRNA 動物實(shí)驗(yàn)中，通常采用滴鼻給藥的方式，費(fèi)時(shí)且影響效果。為了解決這一問題，我們設(shè)計(jì)了一套霧化給藥系統(tǒng)，將包裹脂質(zhì)體的 siRNA 以霧化顆粒的形式吸入式給藥。這樣一方面避免了傳統(tǒng)滴鼻給藥的復(fù)雜過程以及麻醉過程對小鼠呼吸系統(tǒng)的抑制；另一方面也為推動siRNA 作為一種有效的，便捷的常規(guī)治療方式做出有益的嘗試。

[1] Tsai KN, Chen GW. Influenza genome diversity and evolution. Microbes Infect, 2011, 13(5):479-488.

[2] Fodor E. The RNA polymerase of influenza a virus: mechanisms of viral transcription and replication. Acta Virol, 2013, 57(2):113-122.

[3] García-Sastre A, Egorov A, Matassov D, et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology, 1998, 252(2):324-330.

[4] De Clercq E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov, 2006, 5(12):1015-1025.

[5] Bright RA, Shay DK, Shu B, et al. Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005-2006 influenza season in the United States. JAMA, 2006, 295(8):891-894.

[6] Kiso M, Mitamura K, Sakai-Tagawa Y, et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. Lancet, 2004, 364(9436):759-765.

[7] Dave RS, Pomerantz RJ. RNA interference: on the road to an alternate therapeutic strategy! Rev Med Virol, 2003, 13(6):373-385.

[8] Meliopoulos VA, Andersen LE, Birrer KF, et al. Host gene targets for novel influenza therapies elucidated by high-throughput RNA interference screens. FASEB J, 2012, 26(4):1372-1386.

[9] Doi N, Zenno S, Ueda R, et al. Short-interfering-RNA-mediated gene silencing in mammalian cells requires Dicer and eIF2C translation initiation factors. Curr Biol, 2003, 13(1):41-46.

[10] Song JJ, Smith SK, Hannon GJ, et al. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science, 2004, 305(5689):1434-1437.

[11] Ge Q, McManus MT, Nguyen T, et al. RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(5):2718-2723.

[12] Tompkins SM, Lo CY, Tumpey TM, et al. Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(23):8682-8686.

[13] Suzuki H, Saitoh H, Suzuki T, et al. Inhibition of influenza virus by baculovirus-mediated shRNA. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 2009, (53):287-288.

[14] LaBarre DD, Lowy RJ. Improvements in methods for calculating virus titer estimates from TCID50 and plaque assays. J Virol Methods, 2001, 96(2):107-126.

[15] Tannous BA. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc, 2009, 4(4):582-591.

[16] Guo S, Kemphues KJ. Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell, 1995, 81(4):611-620.

[17] Bitko V, Barik S. Phenotypic silencing of cytoplasmic genes using sequence-specific double-stranded short interfering RNA and its application in the reverse genetics of wild type negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol, 2001, 1:34.

[18] Li W, Yang X, Jiang Y, et al. Inhibition of influenza A virus replication by RNA interference targeted against the PB1 subunit of the RNA polymerase gene. Arch Virol, 2011, 156(11):1979-1987.

[19] Zhang W, Wang CY, Yang ST, et al. Inhibition of highly pathogenic avian influenza virus H5N1 replication by the small interfering RNA targeting polymerase A gene. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 390(3):421-426.

[20] Sui HY, Zhao GY, Huang JD, et al. Small interfering RNA targeting m2 gene induces effective and long term inhibition of influenza A virus replication. PLoS One, 2009, 4(5):e5671.

[21] Hui EK, Yap EM, An DS, et al. Inhibition of influenza virus matrix (M1) protein expression and virus replication by U6 promoter-driven and lentivirus-mediated delivery of siRNA. J Gen Virol, 2004, 85(Pt 7):1877-1884.

Study on the activity of novel siRNAs against influenza virus

ZHANG Yong-xin, ZHAO Fei, WANG Yu-jia, ZHANG Rui-xin, CEN Shan

ObjectiveTo design and synthesize the novel siRNAs with universal anti-influenza virus activity which was measured both in vitro and in vivo.

MethodsThe siRNAs were designed targeting at the highly conserved fragments of PB2, PB1, PA, M and NS gene of A/WSN/33 strain. The anti-virus activity screening of siRNAs was carried out with 293T-Gluc system and single-infectious influenza virus sequentially. And the inhibitory effect of siRNAs on influenza virus replication was detected in vitro. Then the in vivo activity of siRNAs was valued in mice by aerosolization delivery.

Results4 siRNAs of siPB2-1, siPB2-2, siPB1-2 and siNS-1 were screened out with above 50% inhibitory activity. The EC50values of siRNAs are between 0.4 to 1.3 nmol/L. The siRNAs also inhibited the replication of another two strains of A/PR/8/34 and B/Beijinghaidian/1386/2013 (Victoria lineage). The animal experiment showed that siPB2-1 protected mice from influenza virus infection via aerosolization delivery.

ConclusionThe independent designed siRNAs possess high anti-influenza virus activity both in vitro and in vivo.

Influenzavirus A; RNA small interfering; Animal experimentation

CEN Shan, Email: shancen@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.003

國家自然科學(xué)基金（81401675、31470076）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室

岑山，Email：shancen@hotmail.com

2017-03-10

*同為第一作者

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(3):207-214

Author Affiliation: Department of Immunology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Union Medical College, Beijing 100050, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):207-214