一種糖類抗原242全自動管式化學發光定量免疫檢測試劑的建立

楊紅賓，劉江武，翁祖星，黃劉女，徐飛海，孫旭東

一種糖類抗原242全自動管式化學發光定量免疫檢測試劑的建立

楊紅賓，劉江武，翁祖星，黃劉女，徐飛海，孫旭東

目的建立一種全自動測定血清糖類抗原 242（CA242）的管式化學發光定量免疫檢測試劑。

方法采用均相磁微粒標記技術與高靈敏的吖啶酯化學發光技術，依據雙抗體夾心原理，以 4 株單克隆抗體為原料進行配對單抗篩選，從而建立 CA242 化學發光磁微粒測定試劑，并在全自動管式化學發光儀上對其靈敏度、精密度、回收率與相關性等進行初步評價。

結果篩選的最優單抗配對 7C10（包被）-3H1（標記）的反應活性最高，且 CA19-9 和 CA50 對 CA242檢測的干擾很小。該試劑的分析靈敏度為 0.69 U/ml，高濃度樣本精密度為 3.0%，低濃度樣本精密度為 5.7%，回收率為101.5%。與當前主流的商品化試劑的定量相關性良好（y = 1.027x – 0.2991，r = 0.9911，P ＜ 0.05）。

結論利用抗 CA242 單抗為原料建立 CA242 全自動管式化學發光定量免疫檢測試劑，該試劑性能良好，所有檢測操作均由儀器自動完成，可滿足目前臨床醫學的高通量檢測需求。

糖類抗原 242； 雙抗體夾心法； 化學發光

胰腺癌是人類死亡率最高的惡性腫瘤之一，根據資料顯示，胰腺癌 5 年生存率僅為 5%，是目前臨床診治最為困難的實體腫瘤[1]。因此，對胰腺癌的早期發現、早期診斷及早期治療被認為是改善患者預后的唯一途徑。CA19-9 是目前臨床證實并廣泛應用的胰腺癌標志物[2]，但在其他胃腸道惡性腫瘤（如膽囊癌）以及慢性胰腺炎、肝炎、膽道梗阻等良性疾病中 CA19-9 也升高[3]，而 CA242 水平卻很少或輕微升高。目前普遍認為，CA242 在胰腺癌的鑒別診斷中有著更高的特異性[4]。有研究表明，將 CA242 與 CA19-9 聯合診斷胰腺癌，靈敏度雖無明顯提高（68.5% ～ 78.1%），特異度卻顯著增加（90.4% ～ 96.6%）[5]。

CA242 是一種唾液酸化的黏蛋白型糖鏈抗原，先由 Colo205 單克隆抗體免疫小鼠得到系列抗體，再經單克隆抗體篩選得到 CA242，它的抗原決定簇為糖鏈結構，出現于黏蛋白表面[6-7]。CA242 與CA19-9、CA50 一樣都是 Lewis a 血型上的抗原決定簇，但 CA242 的抗原決定簇與 CA19-9 和CA50 不同，它不能與唾液酸化的半乳糖苷反應[8]。健康者血清 CA242 含量小于 20 U/ml[9]，臨床上在不同良惡性疾病時，CA242、CA19-9 和 CA50的抗原決定簇出現的機會和程度并不相同。惡性腫瘤發生時，三種抗原決定簇的出現均較正常時明顯增多[10]，但 CA242 對惡性腫瘤的診斷比 CA19-9和 CA50 更加特異[11]。因此糖類抗原 CA242 作為一種較晚發現的腫瘤標志物，具有較優診斷價值。目前國內 CA242 檢測試劑質量參差不齊，臨床上廣泛使用的是瑞典 CanAg 公司生產的酶聯免疫吸附分析法（ELISA）CA242 檢測試劑[12]，但由于是半定量、自動化程度低，操作繁重且耗時較長（4 h）的分析方法，不能很好地滿足臨床需要。為此，我們利用國產 CARIS200 全自動化學發光免疫分析儀和磁微粒子技術結合超敏感的吖啶酯化學發光體系[13]，進行全自動化、高通量、操作簡單方便的 CA242 管式化學發光磁微粒法（CMIA）試劑的研制。

1 材料與方法

1.1 樣本與材料

1.1.1 臨床樣本與 CA242 校準品 206 例臨床血清樣本均由廈門大學提供，包括胰腺癌患者血清樣本 47 例，胰腺炎、膽道梗阻等良性疾病患者血清樣本 90 例，以及 69 例健康體檢者血清，均保存于 –20 ℃。濃度分別為 0.4、2、10、50、250、1250 U/ml 的 6 份 CA242 校準品由本公司進行配制。

1.1.2 主要試劑及耗材 磁微粒 EM1 100/40 為德國 Merck 公司的產品；ECD 為美國 Sigma 公司的產品；吖啶酯和發光激發液均由本公司提供；4 株 CA242 單抗（3H1、7B3、7C10、12F1）均由廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心提供；各種常規化學試劑為國產分析純。

1.1.3 儀器 CARIS 系列化學發光儀為廈門優邁科醫學儀器有限公司的產品；Sunris2 酶標儀購自瑞士 Tecan 公司；CA242 ELISA 檢測試劑盒（含標準品和質控品）為瑞典 CanAg 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 吖啶酯的標記 將吖啶酯加入抗體溶液中，混勻，避光孵育。以甘氨酸溶液終止反應，將得到的產物全部透析至 20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液pH 7.4 中，于 –20 ℃ 避光保存。

1.2.2 磁微粒包被抗體 取磁微粒用 EDC 溶液活化后，加入抗體進行分子偶聯；再用含牛血清白蛋白的 20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液 pH7.4 進行封閉；將封閉后的磁微粒置于 2 ～ 8 ℃ 保存備用。

1.2.3 參比試劑盒的檢測 按照 CA242 ELISA檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 CA242 管式化學發光磁微粒法 首先將標記后的吖啶酯稀釋 200 倍，將包被后的磁微粒稀釋 5 倍，均保存于 4 ℃ 備用。依據雙抗體夾心法原理，檢測步驟為：①加樣：分別取 50 μl 檢測樣本（校準品和血清）和 50 μl 磁微粒于孵育杯內混勻，37 ℃ 孵育 10 min；②加入吖啶酯試劑：取50 μl 抗 CA242 抗體-吖啶酯標記物試劑，加入孵育杯內，37 ℃ 孵育 20 min；③洗滌：用專用洗滌液洗滌 2 遍；④發光：加入 50 μl 激發液，混勻；⑤讀值：測定樣本的相對發光強度，根據校準曲線，計算出樣本中 CA242 的濃度。

圖 1 單抗配對組合的篩選結果Figure 1 Screening of monoclonal antibody pairs

2 結果

2.1 單抗最優配對組合的獲得

為了排除人血清中內源性 CA19-9 或 CA50的干擾，對陽性與陰性對照樣本進行內源性 CA19-9或 CA50 確認。根據 CA242、CA19-9 和 CA50 的濃度挑選出三組樣本作為 CA242 的陽性對照（CA242 為 113.35 U/ml、CA19-9 為 304.04 U/ml、CA50 為 74.73 U/ml）、假陽性對照（CA242 為3.91 U/ml、CA19-9 為 63.54 U/ml、CA50 為37.82 U/ml）、陰性對照（CA242 為 3.84 U/ml、CA19-9 為 13.17 U/ml、CA50 為 4.56 U/ml）。基于雙抗體夾心法原理進行抗體配對篩選，將 4 株單抗（3H1、7B3、7C10、12F1）進行 12 組交叉配對組合，檢測三份樣本（陽性對照、假陽性對照、陰性對照），根據檢測的相對發光強度（RLUs），篩選特異性強、信噪比好的抗體配對。結果（圖 1）顯示，7C10（包被）-3H1（標記）抗體組合的試劑陽性對照的反應活性最高，雖然陰性樣本本底偏高，但假陽性對照與陰性對照的相對發光強度一致，表明該抗體配對檢測 CA242 受 CA19-9 和CA50 的干擾小。

2.2 CA242 CMIA 方法的標準曲線繪制

采用 GraphPad Prism5.0 軟件進行四參數（4PLC）擬合，以 CA242 校準品的濃度為 x 軸，檢測的發光信號值為 y 軸，繪制劑量反應曲線（圖 2），校準品濃度與信號強度呈良好相關性（r = 0.9999）。

圖 2 CA242 CMIA 標準曲線Figure 2 CA242 CMIA calibration curve

2.3 分析靈敏度評價

重復測定 0 U/ml 樣本 20 次，計算其平均相對發光強度（X）、標準差（SD），得出 X + 2SD，然后將 X + 2SD 的 RLUs 值帶入標準曲線方程中，求出對應的分析靈敏度平均值為 0.69 U/ml。

2.4 精密度（CV）評價

重復測定 CA242 高、低濃度樣本（約 100 U/ml與 10 U/ml）各 10 次，計算測定值的平均值和標準差（SD），按照公式 CV = SD/平均值 × 100%，計算精密度。本試劑的高濃度樣本精密度為 3.0%，低濃度樣本精密度為 5.7%。

2.5 回收率檢測

將 CA242 高濃度標準血清按 1∶9 的比例加入 3 份正常人血清，測定回收率為 101.5%。

2.6 與 CanAg 公司的 CA242 ELISA 試劑的比較

將本試劑與 CanAg 公司的 ELISA 試劑平行檢測 206 份臨床樣本，采用 GraphPad Prism5.0 軟件進行相關性分析，結果顯示兩者相關系數 r 值為0.9911，斜率為 1.027，截距為 –0.2991（圖 3），表明兩者的定量相關性良好。

圖 3 CMIA 法與 ELISA 法的血清 CA242 定量相關性Figure 3 The correlation of determination serum CA242 between CMIA and ELISA

3 討論

由于 CA242 與 CA19-9、CA50 一樣都是Lewis a 血型上的抗原決定簇[8]，可以捕獲CA242的抗體，可能也可捕獲 CA19-9 與 CA50。因此在雙抗體夾心法檢測 CA242 時，抗體配對的組合尤為關鍵，至少要保證其中一株抗體能夠特異性地識別 CA242 的抗原決定簇。在 CanAg 公司的CA242 ELISA 法中，捕獲抗體 MAb C242 特異性識別 Lewis a，測定抗體 MAb C242 特異性地與CA242 抗原決定簇結合。本研究在獲得關鍵的4 株單克隆抗體原料后，將對 CA242 呈陽性的這4 株鼠單抗進行組合配對，為了最大程度的減小臨床樣本中內源性 CA19-9 與 CA50 的干擾，本研究設置了一組假陽性對照，排除了篩選出的捕獲和測定抗體都僅特異性識別 Lewis a 的情況，因此，對于抗體配對篩選的準確性有明顯的促進作用。目前 CA242 測定常用的方法有放射免疫分析法（RIA）、ELISA 和化學發光免疫分析法（CLIA）等。RIA 具有受外界因素影響較小，可直接測定、靈敏、高效的優點，可檢測濃度達 0.08 U/ml。但它存在放射性污染、同位素衰變、半衰期短、標準曲線穩定性差、操作復雜、時間長、重復性欠佳等問題，臨床已很少使用 RIA 分析 CA242。ELISA使用最為廣泛，但該法的局限性明顯，如：①手工操作，每個工作日一般只能進行一次檢測；②操作步驟和影響因素較多。本研究采用的磁微粒標記工藝與吖啶酯標記工藝均經過了不斷優化，確定了最佳的標記條件及標記濃度，在檢測體系方面，本CMIA 法結合全自動儀器進行了各組分最佳工作濃度、孵育時間、洗滌次數等一些優化，從而保證了試劑與儀器較好的配套。本研究建立的 CA242全自動的 CMIA 分析法整個檢測過程耗時約30 min，由于管式化學發光全自動化的優勢，可保證每小時檢測 200 個樣本。本試劑檢測 CA242 分析靈敏度可達到 0.69 U/ml，線性范圍可達 3 個數量級，明顯寬于 ELISA 法。與 CanAg 公司的ELISA 法進行定量相關性分析，結果表明本試劑測定血清 CA242 與市售試劑相關性好，且定量準確，可滿足目前現代臨床醫學檢測需求。

[1] Roy N, Malik S, Villanueva KE, et al. Brg1 promotes both tumor-suppressive and oncogenic activities at distinct stages of pancreatic cancer formation. Genes Dev, 2015, 29(6):658-671.

[2] Li FM. The significance of CEA, CA19-9 and CA242 in the diagnosis of pancreatic. J Radioimmunology, 2010, 23(4):448-449. (in Chinese)李鳳妹. CEA、CA19-9及CA242 聯檢在胰腺癌診斷中的意義. 放射免疫學雜志, 2010, 23(4):448-449.

[3] Huang ZB, Zhou X, Xu J, et al. Prognostic value of preoperative serum tumor markers in gastric cancer. World J Clin Oncol, 2014, 5(2): 170-176.

[4] Kim J, Lee YS, Hwang IK, et al. Postoperative carcinoembryonic antigen as a complementary tumor marker of carbohydrate antigen 19-9 in pancreatic ductal adenocarcinoma. J Korean Med Sci, 2015, 30(3):259-263.

[5] Harsha HC, Kandasamy K, Ranganathan P, et al. A compendium of potential biomarkers of pancreatic cancer. PLoS Med, 2009, 6(4): 1000046.

[6] Wang S, Yin J, Li T, et al. Upregulated circulating miR-150 is associated with the risk of intrahepatic cholangiocarcinoma. Oncol Rep, 2015, 33(2):819-825.

[7] Alberti C. Cytoskeleton structure and dynamic behavior: quick excursus from basic molecular mechanisms to some implications in cancer chemotherapy. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2009, 13(1):13-21.

[8] Zhang HL, Jia AP, Xing L. Correlation between the expression of various tumor markers in the level of intraperitoneal drainage fluid in patients with colorectal cancer and its relationship with disease. Int J Lab Med, 2014, 35(1):105-106. (in Chinese)張海林, 賈愛萍, 邢麗. 多種腫瘤標志物在結直腸癌患者術后腹腔引流液中水平的表達與疾病的相關性研究. 國際檢驗醫學雜志, 2014, 35(1):105-106.

[9] Palmqvist R, Engar?s B, Lindmark G, et al. Prediagnostic levels of carcinoembryonic antigen and CA 242 in colorectal cancer: a matched case-control study. Dis Colon Rectum, 2003, 46(11):1538-1544.

[10] Haglund C, Lundin J, Kuusela P, et al. CA 242, a new tumour marker for pancreatic cancer: a comparison with CA19-9, CA50 and CEA. Br J Cancer, 1994, 70(3):487-492.

[11] Zhang LZ, Gong YF, Tu ZX. Quantitative determination of serum levels of CA242 in patients with pancreatic cancer and its significance. Chin J Pancreatol, 2002, 20(1):20-21.(in Chinese)張樂之, 龔燕芳, 屠振興. 胰腺癌患者血清 CA242定量測定及其意義. 胰腺病學, 2002, 20(1):20-21.

[12] Engar?s B. Individual cutoff levels of carcinoembryonic antigen and CA 242 indicate recurrence of colorectal cancer with high sensitivity. Dis Colon Rectum, 2003, 46(3):313-321.

[13] Gámiz-Gracia L, Garca-Campa?a AM, Soto-Chinchilla JJ, et al. Analysis of pesticides by chemiluminescence detection in the liquid phase. TrAC Trends Anal Chem, 2005, 24(11):927-942.

Development of an automatic chemiluminescence test kit for detection of carbohydrate antigen 242

YANG Hong-bin, LIU Jiang-wu, WENG Zu-xing, HUANG Liu-nv, XU Fei-hai, SUN Xu-dong

ObjectiveTo develop a chemiluminescence microparticle immunoassay (CMIA) to detect serum human carbohydrate antigen 242(CA242) level.

MethodsBased on double antibody sandwich principle, we screened the paired combinations of four monoclonal CA242 specific antibodies. Parameters including sensitivity, precision, rate of recovery, and correlation assay were further evaluated in the assay.

ResultsThe reactivity of 7C10 (coated) -3H1 (labeled) was the highest and CA19-9 and CA50 do not interfere with the detection of CA242. The coefficient of variation of the assay was 3.0% and 5.7%. The sensitivity was 0.69 U/ml and the rate of recovery was 101.5%. The assay correlates well with the current commercial kit (y = 1.027x – 0.2991, r = 0.9911, P ＜ 0.05).

ConclusionThe assay performs well and all the testing operations are completed automatically.

Carbohydrate antigen 242; Double-antibody sandwich method; Chemiluminescence

SUN Xu-dong, Email: xudong.sun@innodx.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.008

100050 北京，首都醫科大學附屬北京天壇醫院離退休辦公室（楊紅賓）；361022 廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司（劉江武、翁祖星、黃劉女、徐飛海、孫旭東）

孫旭東，Email：xudong.sun@innodx.com

2017-04-05

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2017, 12(3):238-241

Author Affiliations: Office of Retirement Services, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China (YANG Hong-bin); Xiamen Innodx Biotech Co. Ltd., 361022 China (LIU Jiang-wu, WENG Zu-xing, HUANG Liu-nv, XU Fei-hai, SUN Xu-dong)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):238-241