人成體神經干細胞長期培養后遺傳穩定性研究

陳世明，章瑾，王卓然，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

人成體神經干細胞長期培養后遺傳穩定性研究

陳世明，章瑾，王卓然，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

神經干細胞因具有自我更新、增殖和多向分化潛能[1]，神經干細胞移植已成為治療神經系統的損傷和神經退行性疾病的新方法[2-5]。但神經干細胞的體外培養仍存在許多技術難點，培養過程中細胞易分化或凋亡，難以長期培養[6]。且培養過程中易產生遺傳漂變、微生物污染、細胞交叉污染等問題[7]。培養傳代時，一般使用化學性酶，如胰蛋白酶等分離神經干細胞球，酶的多次使用對長期培養的神經干細胞可能產生累積損傷[8-11]。因此，經體外長期培養后神經干細胞的增殖分化能力，尤其是遺傳信息穩定性依然未知。我們以物理方法切割分離神經干細胞球，并改良了神經干細胞培養液，成功實現神經干細胞的體外長期培養[12]。但該方法是否存在遺傳不穩定性仍需要進行研究。本文通過對體外傳代培養不同時間的神經干細胞進行短串重復序列（STR）分析和端粒酶活性鑒定，為神經干細胞的體外長期培養的遺傳穩定性提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM/F-12（1∶1）培養基購自美國 Hyclone 公司；人重組表皮細胞生長因子（rhEGF）、人重組堿性成纖維細胞生長因子（rhbFGF）、N2 Supplement 均購自美國 Gibco公司；16 位點 STR 試劑盒和 2800 M DNA 標準品購自美國 Promega 公司；TeloTAGGG 端粒酶 PCR-ELISA 試劑盒購自瑞士羅氏公司；巢蛋白購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 神經干細胞培養 取流產胎兒腦組織，在無菌條件下分離出海馬組織，D-Hank’s 液清洗，眼科剪剪成小組織塊，加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min，胰酶抑制劑終止其消化。用 100 目不銹鋼細胞過濾篩過濾，去除大組織塊，離心收集沉淀細胞。將沉淀細胞重懸于神經干細胞培養基，制成單細胞懸液。經過細胞計數后以（1 ～ 2）× 106/ml接種到 T75 細胞培養瓶中。將細胞培養瓶置于 5% CO2、37 ℃ 培養箱中進行培養。每天觀察細胞生長狀態，3 ～ 4 d半量更換神經干細胞培養基一次。每月用自行研制的干細胞球切割器切割分離傳代一次。

1.2.2 神經干細胞球及分化細胞觀察 分別取神經干細胞球懸液滴于經多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，置 37 ℃ 培養箱中培養 24 h，使細胞黏附于載玻片上，倒置顯微鏡下觀察結果并照相記錄。

1.2.3 神經干細胞的 STR 分析法 按 STR 試劑盒說明書操作，檢測體外培養 2、6、12 和 30 個月的神經干細胞的短串聯重復序列。取 1 × 106個細胞經胰酶消化后，加入裂解液裂解，再加入平衡酚、氯仿、異戊醇提取 DNA，無水乙醇清洗后棄上清，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，對 PCR產物進行 STR 測序。

1.2.4 神經干細胞端粒酶活性檢測 按端粒酶試劑盒說明書檢測體外培養 2、6、12、24 個月的神經干細胞。空白對照為 DEPC 水，陰性對照選擇 RNase 處理的神經母細胞瘤 IMR-32 細胞，陽性對照選擇神經母細胞瘤 IMR-32 細胞及試劑盒提供的人腎細胞 293 凍干粉。取培養后的神經干細胞，胰酶消化，臺盼藍染色并計數。取約 2 × 105個細胞，加入裂解液裂解，孵育、離心后取上清進行端粒酶催化特異底物反應的 PCR。PCR 產物變性后按試劑盒要求用地高辛標記的特異探針雜交，而后用偶聯過氧化物酶的抗地高辛抗體行 ELISA 反應，酶標儀測定 ELISA 結果（檢測波長為 450 nm，參考波長為 690 nm）。測定值大于 0.25 為端粒酶陽性。

2 結果

2.1 神經干細胞球及分化細胞觀察

傳代培養 30 個月神經干細胞球形態見圖 1，神經干細胞的分化細胞形態見圖 2。

圖 1 倒置顯微鏡下觀察人神經干細胞球（× 100）

2.2 STR 分析

通過檢測發現，2、6、12 和 30 個月培養的神經干細胞均有相同的短串連重復序列（表 1）。

圖 2 神經干細胞球部分分化[A：經誘導分化的神經干細胞球（× 100）；B：神經干細胞分化后的神經細胞（× 100）；C：神經干細胞分化后的神經細胞（× 200）；D：神經干細胞分化后的神經細胞（× 400）]

表 1 不同培養時間的神經干細胞短串連重復序列檢測結果

2.3 端粒酶活性測定

結果（圖 3）顯示，陽性對照和 IMR-32 細胞具有較高的端粒酶活性。2、6、12、24 個月培養的神經干細胞均為陰性。

3 討論

圖 3 不同培養時間的神經干細胞端粒酶活性

神經干細胞在體外培養過程中極易分化，并發生微生物污染、細胞間交叉污染等問題，長期傳代培養又易導致細胞遺傳信息的漂移和變異[13]，進而出現異常分化、基因不穩定和癌變等現象，因此，在神經干細胞培養過程中，對其遺傳穩定性的檢測尤為重要。實驗中神經干細胞球的形態在30 個月內無明顯變化。體外培養 30 個月后神經干細胞球分化后，可見典型神經元形態及星型膠質細胞形態，可判斷此類細胞仍具有良好的增殖和分化能力。

短串聯重復序列（STR）在遺傳病及親子鑒定等方面已廣泛應用，但在細胞培養中，主要檢測基因變異和細胞交叉污染[14]。通常情況下，每一個 STR 位點會被 5% ～ 20% 的人們所共有，理論上聯合應用 16 個 STR 位點，其個體識別率可達 99.9999999998%。在細胞培養過程及 STR 過程中的微量 DNA 污染，會造成錯誤的實驗結果。STR 檢測過程中，DNA 樣品提取純化的質量、緩沖液的微小差異、離子強度、引物濃度等，甚至不同的熱循環條件，都會引起實驗結果的偏差。本實驗通過對神經干細胞特殊基因位點進行多態性分析，不但檢測了交叉污染情況，也能說明長期培養的遺傳穩定性。實驗結果表明，在神經干細胞體外培養的 30 個月時間內，Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358，Penta D、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818，FGA、TPOX、D8S1179、vWA、Amelogenin 位點在不同時間段均具有相同的基因重復次數，可準確判斷細胞具有穩定的遺傳信息，且無任何交叉污染，各組之間并無遺傳突變。

干細胞在自我更新、增殖分化、信號轉導等方面與腫瘤細胞有著相似的生物學特征，尤其是在自我更新越頻繁的組織中，干細胞自我更新越快，腫瘤發生率越高[15]。因此，在神經干細胞長期培養過程中，對其不同階段的癌變可能性檢測十分必要。而對細胞端粒酶的活性檢測，不僅能滿足以上要求，還能從側面反應出細胞培養的穩定性。端粒重復序列擴增法（TRAP）的誕生及應用，大大提高了檢測的敏感度，已成為端粒酶活性檢測最常用的方法。端粒酶活性檢測實驗中，細胞的培養、使用細胞量、RNA 提取及 ELISA 反應條件，對實驗結果均有影響。本實驗結果中培養至 2、6、12、24 個月，神經干細胞的端粒酶活性均為陰性，而神經母細胞瘤 IMR-32 細胞具有較高的端粒酶活性。端粒酶能修復延長端粒，可以讓端粒不會因細胞分裂而有所損耗，使得細胞分裂的次數增加。當端粒酶活性不足以抑制端粒長度的縮短，致使細胞喪失增殖能力[16]。Ostenfeld 等[17]研究表明，人神經干細胞的端粒較短，并隨著細胞分裂進一步縮短，致使神經干細胞不能在體外長期傳代。而腫瘤細胞端粒酶活性很高，每次腫瘤細胞分裂后縮短的端粒被端粒酶延長，致使細胞長期無限增殖。本實驗結果中，神經干細胞經體外培養 12 ～ 24 個月后，端粒酶活性與之前各組并未顯示顯著差異，自我更新、增殖分化能力亦未見異常，可能與神經干細胞培養和傳代的特殊方法有關，也可能與端粒酶測試方法的敏感度有關，具體原因有待進一步研究驗證。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.015

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陳世明，Email：1279050771@qq.com

2017-02-03