黃連素和吳茱萸堿協同抗癌的miRNA網絡機制研究

尹作靜,曹志偉,閆鑫淼,陽奕琰,盛 振

(同濟大學生命科學與技術學院，上海 200092)

黃連素和吳茱萸堿協同抗癌的miRNA網絡機制研究

尹作靜,曹志偉,閆鑫淼,陽奕琰,盛 振

(同濟大學生命科學與技術學院，上海 200092)

目的 從miRNA 及其調控的通路網絡水平，研究黃連素和吳茱萸堿產生協同抗癌作用的機制。 方法 先在細胞水平上驗證并詳細分析了黃連素與吳茱萸堿對腫瘤細胞增殖的抑制作用，確定了二者的劑量效應范圍及協同作用產生的濃度配比，然后采用基因表達芯片技術分析了黃連素和吳茱萸堿處理后的肝癌細胞BEL-7402的miRNA表達譜，通過構建miRNA-mRNA互作網絡，對二者的協同作用機制進行闡釋。 結果 黃連素與吳茱萸堿合用可以明顯協同抑制肝癌細胞BEL-7402的增殖能力； 合用后產生的差異miRNA(DEmiRNA) 主要參與MAPK信號通路、內吞通路及胰島素信號通路等癌癥增殖相關通路的調控；合用影響的特異的靶基因既涵蓋了通路上游細胞膜上的3類膜受體，又參與到下游信號通路的轉導。結論 從miRNA的調控關系可以看出，黃連素可能在兩藥協同抑癌作用中起著主要的作用。 黃連素和吳茱萸堿在miRNA水平上協同機制的闡釋，為今后協同藥物組合的發現提供了一種新的思路。

黃連素；吳茱萸堿；聯合用藥；協同用藥；作用機制；KEGG通路；通路網絡

癌癥，由于其高發病率和高致死率，在參與藥物研發的疾病中所占比重逐年增長[1]。在傳統的癌癥治療中，“單成分-單靶點”的藥物往往由于腫瘤細胞耐藥性的迅速產生而逐漸失去療效[2]，或者由于對機體的毒副作用大，嚴重影響患者的生存質量而導致治療效果不佳[3]。而協同藥物組合，比單藥療法具有更好的整體治療效果，并且具有增效減毒，劑量降低的優勢，日益受到藥物研發人員和臨床醫生的青睞[4]。

目前關于協同作用機制的研究主要是從藥物作用后影響的單個生物學過程如細胞凋亡等來研究，或只考慮了單一的通路上基因表達的變化[5]。2009年，新加坡國立大學Yuzong Chen教授課題組對藥物組合進行了歸類，并針對每一類藥物組合，探索了它們的作用機制。他們的研究指出，藥物效應上的協同作用以及藥物代謝上的增效作用被認為是有效的藥物組合。其中，藥物效應上的協同作用主要通過藥物靶向到疾病網絡的不同位置來實現的[6]。

最近有研究發現，miRNA的表達與多種癌癥的發病機制相關[7]，大約50%得到注解的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點，這說明miRNA可能在腫瘤發生過程中起著至關重要的作用[8]。并有研究顯示，中藥及其成分可以通過影響表達異常的miRNA來調控相應靶基因或靶蛋白，進而誘導腫瘤細胞的凋亡[9]。因為miRNA與其靶mRNA的調控關系是多對多的，不同的miRNA可以通過調控關系與它們的靶mRNA形成特定的網絡結構和調節模塊，從而相互協同地發揮作用[9]。中藥多成分之間可能也會通過調節不同miRNA的表達，從而協同地改變了特異性mRNA的翻譯活性，進而產生特定的藥理學協同效應。

近年來有研究發現，中藥單體化合物黃連素與吳茱萸堿具有多種抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡、減少腫瘤的惡性轉化和轉移等[10]。前期實驗研究發現，聯合使用這兩種中藥成分在胃癌等癌癥中有明顯的協同抗癌效果[11]。然而，其協同抑癌作用機制還不夠清楚。

本文主要從黃連素和吳茱萸堿單用及合用于肝癌細胞后miRNA表達水平的變化及其對靶基因的調控，結合KEGG通路網絡，從通路網絡層面分析兩藥產生協同作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及藥物處理 BEL-7402細胞以5 ×108·L-1培養于10 cm的培養皿中，細胞貼壁生長12 h后，據MTT實驗結果，分別加入單藥或者合用藥物的IC50劑量處理BEL-7402細胞24 h。抽提和純化RNA，并做miRNA芯片實驗。實驗分成4組：對照組、黃連素處理組(BER)、吳茱萸堿處理組(EVO)、黃連素和吳茱萸堿合用處理組(BER+EVO)。

1.2 miRNA芯片數據的獲得及差異miRNA的篩選 黃連素和吳茱萸堿單用和合用于肝癌細胞BEL-7402后的miRNA芯片，由上海伯豪生物技術有限公司提供。芯片平臺是Agilent human miRNA(8×15k) v12.0芯片(design ID：21827)，每組包括4個樣本，14 752個miRNA。

歸一化后的芯片數據，通過以下參數來篩選差異表達的miRNA：① 倍數差異(Fold Change)：一般寫成FC，就是將待比較的兩個標準化以后的信號相除得到的數值。即Fold Change = Signal A/Signal B。② 顯著性檢驗：進行統計學t檢驗，計算P值。③ 每個探針點的Flag值/Call值，表達譜芯片中用A、P、M來表示3種不同的情況：A-Absent，表示該探針點信號與背景信號差異無顯著性；P-Present，表示該探針點信號與背景信號差異具有顯著性；M-Marginal，表示該探針點的信號與背景的差異介于A和P之間。

本實驗確認差異表達miRNA的參數如下：①P<0.05，并且FC>=2或FC<=0.5；② 每個探針點的Flag值設定閾值為至少一組內不出現A。

1.3 差異miRNA對應靶基因的篩選及功能富集 將篩選出的差異的miRNA通過miRWalk軟件查找到對應的靶基因。miRWalk軟件收集了來自5個數據庫的miRNA對應的靶基因信息，分別包括miRWalk、miRanda、Pictar2、RNA2、Targetscan。為了確保查找到的靶基因的準確性，選擇至少在4個數據庫中被證實的靶基因。

為分析差異miRNA影響的生物學功能，分別將差異miRNA對應的靶基因通過DAVID軟件富集到GO生物學過程和KEGG通路中，取FDR<0.01。并對富集的GO生物學過程用DAVID軟件中的clustering做聚類分析，對聚為一類的GO生物學過程的FDR值取平均，作為新聚成的GO生物學過程的顯著性P值。

為分析合用后影響的通路中的基因組成，分別以合用后影響的4類靶基因(合用特異的靶基因、分別與兩藥單用共同的靶基因、單用及合用共同的靶基因)與富集通路中基因的交集在通路總基因中所占的比例作為此類靶基因對于該條富集通路的貢獻率，比值越大，表示貢獻率越大。并對于4類靶基因，取其與某條通路基因的交集與其在所有靶基因中所占的比例做卡方檢驗，如果P值小于0.05，則認為該通路對靶基因的選擇具有偏好性。

1.4 KEGG通路的網絡分析 將KEGG中目前存在的所有通路蛋白或基因的調控關系解析出來，針對用藥后靶基因富集的幾條明顯通路，構建通路網絡，并聯合藥物作用后的差異miRNA的調控信息，從通路網絡的角度分析兩藥協同作用的機制。

2 結果與討論

2.1 兩藥合用的協同效果分析 由Fig 1看出：黃連素和吳茱萸堿都可以抑制腫瘤細胞BEL-7402的增殖。48 h處理后的IC50值分別為：黃連素57.36 μmol·L-1，吳茱萸堿4.68 μmol·L1。 這一結果表明吳茱萸堿對BEL-7402的毒性作用可能略強于黃連素。另外，根據CI分析，二者合用(黃連素 ∶吳茱萸堿=10 ∶1)情況下，其CI值大部分都小于1，表明二者可以產生協同作用[12]。為了從miRNA水平上解釋兩藥協同作用的機制，本文選用miRNA芯片對藥物處理24 h 前后 BEL-7402細胞內miRNA的表達量的變化進行檢測。

Fig 1 Influence of drugs on proliferation of liver cancer cell BEL-7402

The left figure stands for the dose-effect relationship. The ratio of berberine and evodiamine is 10 ∶1, and the X axis stands for the dose of berberine. The right figure stands for the CI value of the combination of berberine and evodiamine. If the CI is less than 1, it stands for the synergistic effect

Fig 2 The quality control of miRNA chips

2.2 miRNA芯片的質量分析 為檢測miRNA芯片的質量，根據芯片結果，繪制不同處理條件下miRNA平均表達值的散點圖，由Fig 2看出，4種不同處理條件下miRNA的平均表達值沒有偏離正對角線，表明芯片的質量較高，可以用于后續的分析。

2.3 差異miRNA的篩選和靶基因預測及功能富集 黃連素和吳茱萸堿單用及合用后差異表達的miRNA分別有10、5、32個(其中上調分別為4、4、9個，下調分別為6、1、23個)。 合用后影響的miRNA中有3個(hsa-miR-188-5p，hsa-miR-23b*、hsa-miR-663)是與兩藥單用重疊的，4個(hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-135a*、hsa-miR-572、hsa-miR-630)是與黃連素單用重疊的，而25個是合用新產生的。3種不同處理條件下的差異miRNA列表見Appendix Tab 1。合用特異的差異miRNA如Tab 1所示。

有意思的是，合用后影響的特異miRNA中，有近70%的miRNA的表達量在藥物處理后發生了明顯的下調。幾個典型的miRNA中，hsa-miR-1225-5p經研究證明在胃癌樣本中差異表達，并且可以作為胃癌術后的腹膜復發的重要生物標記[13]。hsa-miR-125a-3P可以通過激活p53通路中p53的表達來誘導肺癌細胞的凋亡[14]。這些間接地說明合用后產生的特異的差異miRNA與癌癥的發生發展有密切的聯系。

由Fig 3可以看出，黃連素單用與兩藥合用，不論在miRNA水平上，還是靶基因水平上，重疊度都比較高。這說明黃連素可能在兩藥聯合作用時起到了主要的作用，干擾作用更大更廣泛。兩藥合用后，特異性的miRNA占78%，特異性的靶基因占43.9%，這些特異性的差異miRNA和靶基因可能與兩藥產生協同作用有著密不可分的關系。

Tab 1 The special DEmiRNAs induced by drug combination

Appendix Tab 1 List of DEmiRNAs

The “b” in parentheses stands for DEmiRNA under berberine; the “e” stands for DEmiRNAs under evodiamine; the “c” stands for DEmiRNAs under combination.

Fig 3 The venn plot of DEmiRNAs and target genes under different treatment

為研究兩藥合用后影響的生物學過程和生物學通路，我們對差異miRNA的靶基因分別進行GO生物學過程和KEGG通路富集分析。由Fig 4A看出，與兩藥單用相比，合用后特異性地調控了代謝、 微管的發育和形態發生、感覺器官的形成、泌尿和腎臟的發育等生物學過程。研究表明，癌癥的發生與某些基礎代謝相關，mTORC能夠調控肝癌細胞中FGF19的代謝，因此可以作為靶向治療肝癌的靶蛋白[15]。兩藥單用和合用都能夠對磷酸化、神經的分化與發育等生物學過程產生調控。有研究表明，AKT的抑制劑AZD5363能夠通過抑制AKT信號通路下游分子的磷酸化，來抑制肝癌中Hep-G2和Huh-7細胞的磷酸化，從而達到抑制肝癌細胞增殖的目的[16]。有研究表明，神經元-神經膠質抗原的過表達，預示著肝細胞癌預后效果不好，間接說明了肝癌與神經的活動有關[17]。

Appendix Tab 2 The gene preference and gene contributions in pathways

The first column stands for the enriched pathways; the second column stands for the gene preference; the last 4 columns stand for the gene contributions to the pathways.

由Fig 4B看出，在富集的KEGG通路上，合用后明顯影響的通路主要包括胰島素信號通路，軸突信號通路等。特異性影響的通路主要包括Ⅱ型糖尿病，黏著斑，內吞等通路。有研究表明，臨床上發現有很多腫瘤都存在通過神經進行局部擴散的現象，并且目前大量的動物實驗表明，癌細胞天生就有通過軸突在某種機制下激活遷移的能力[18]。并有研究表明，靶向篩查和治療丙型肝炎，治療糖尿病并預防初級肥胖，是降低未來肝癌發病率的關鍵[19]，間接說明糖尿病與肝癌有一定的聯系。有趣的是，合用明顯影響的通路也是黃連素單用也可以影響的，說明合用影響的這些通路來自于黃連素的作用。單用和合用共同影響的通路主要包括與癌癥發展相關的MAPK信號通路、神經信號通路等。

通過對合用影響的通路基因偏好性及基因貢獻率的分析(Appendix Tab 2)，發現合用明顯影響的通路中，軸突導向通路，MAPK信號通路，前列腺癌通路，神經營養蛋白信號通路，結腸直腸癌通路等對于基因具有偏好性，并且在這些具有靶基因偏好性的通路中，合用與黃連素共同的靶基因、單用及合用共同的靶基因，對于通路的貢獻率大，說明黃連素可能在兩藥協同作用中起著主要的作用。

2.4 KEGG 通路網絡的分析

2.4.1 KEGG 通路的選取及基因整合 為從網絡水平上分析兩藥協同作用的機制，從合用后影響的通路中，挑選出顯著性強的5條通路。 并根據KEGG數據庫中基因的整合信息，對靶基因進行整合，得到整合后的靶基因映射的通路網絡。

2.4.2 KEGG通路網絡的構建 在cytoscape軟件中，分別將黃連素、吳茱萸堿單用對應的靶基因映射到合用后富集的5個通路網絡中。重點分析網絡中兩類關鍵的靶基因：第一類靶基因是兩藥合用影響的特異靶基因，另一類靶基因是兩藥單用和合用共同影響的靶基因。調控兩類靶基因的miRNA以及FC值，如Tab 2。

由Tab 2可以看出，兩藥合用后，調控特異靶基因的miRNA，FC值都小于0.5，表明miRNA被下調。由于miRNA表達的變化與基因表達的變化往往是相反的，因此對應的靶基因很可能被上調。而對于單用和合用共同影響的靶基因來說，黃連素主要使得這些靶基因表達下調。在miRNA水平上，有研究表明，hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-188-5p在乳腺癌等癌細胞中表達上調，并可以通過此特征來判斷是否患有乳腺癌[20]，而黃連素能夠起到下調hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-188-5p的作用，吳茱萸堿主要起到上調這些miRNA表達的作用。在靶基因水平上，有研究表明，在肝癌細胞系SMMC-7721中，AQP9的過表達，降低了PI3K的表達，從而抑制了肝細胞瘤的浸潤、轉移和體內異種移植腫瘤的生長[21]。吳茱萸堿主要影響這些靶基因低表達，而兩藥合用影響的miRNA主要誘導這些靶基因高表達，說明黃連素在兩藥合用時可能起到主要作用，而吳茱萸堿可能起到平衡黃連素的輔助作用。

Tab 2 The FC values of DEmiRNAS

兩藥合用后差異miRNA的靶基因富集的KEGG通路網絡圖，如Fig 5。從Fig 5聯合用藥差異miRNA的靶基因富集的通路可以得到，在癌細胞膜上，兩藥合用主要影響到4類膜受體，包括酪氨酸激酶受體：RTK；腦信號蛋白受體：PLEXINA、PLEXINB，主要參與信號轉導、軸突引導、浸潤性生長和細胞轉移等；橫跨模信號受體：SEMA4D，在細胞間的信號轉導中起重要作用，指導中樞神經系統中軸突的生長；Wnt信號蛋白受體：FRIZZLED，具有G蛋白偶聯受體和橫跨膜信號受體的活性，與癌癥通路相關。在癌細胞內部，兩藥合用主要明顯影響到5條與癌癥發生發展相關的信號通路，分別為Calcium signaling 通路、mTOR signaling通路、PI3K-AKT signaling通路、MAPK signaling通路、Wnt signaling通路。這些信號通路的擾動主要影響細胞的生長，擴增和分化等，進而引發癌癥。

合用影響的靶基因還參與7個與癌癥發生相關的生物學過程，分別為受體泛素化的降解、細胞周期的進程，肌動蛋白骨架的調控等。有文獻證實，黃連素能夠影響細胞周期，進而調控細胞的生長進程[22]。并且黃連素有使受體泛素化并降解的作用，在與其他藥物產生協同抗癌作用時發揮重要作用[23]。有趣的是，兩藥合用時影響一種特殊的生物學過程：調控肌動蛋白細胞骨架(regulation of actin cytoskeleton)，有文獻證實肌動蛋白的異常活動可以引發癌癥[24]。合用影響的特異靶基因既分布于上游的細胞膜上，又參與到下游信號通路的轉導，并且調控這些靶基因的miRNA都明顯低表達。這與先前已知的很多抗癌藥物都是根據膜受體設計的報道，具有一致性[25]。

黃連素和吳茱萸堿作用的蛋白靶點具有一定的重合。總體來說，黃連素作用的蛋白靶點比吳茱萸堿作用的靶點多，由Fig 5看出，在合用明顯影響的5條通路中，有3條通路的下游是由黃連素影響的特異靶基因靶向的。在MAPK signaling 通路，Wnt signaling 通路中，上下游都是由聯合用藥來調控的，有可能改變了細胞骨架，調控了基因的轉錄水平，抑制了細胞的擴增，促進了細胞的分化。 黃連素和吳茱萸堿合用后，細胞膜上的4類膜受體，除了橫跨膜信號受體SEMA4D沒有靶向之外，其他3類膜受體都被靶向了，這說明協同作用的藥物組合傾向于靶向更多種類的膜受體，可能會起到增強對信號通路下游的抑制，從而進一步放大藥物協同作用的目的。

Fig 4 Enriched GO_BPs and KEGG pathways

In fig 4-1, the x axis stands for the enriched GO_BPs, the y axis stands for the-log(P); In fig 4-2, the x axis stands for the treatments, the y axis stands for the enriched KEGG pathways. The points stand for the numbers of the target genes. The larger is the point, the more target genes in the enriched pathways. The color stands for the-log(pvalue). The deeper of the color is, the more significant of the enrichments.A:Protein amio acid phosphorylation;B:Neuron differentiation;C:regulation of transcription;D:Ras protein signal transduction;E:regulation of kinase activity;F:vesicle-mediated transport;G:positive regulation of apoptosis…;H:response to organic substance;I:tube development and…;J:sensory organ development;K:urogenital system and kidney…;L:metabolic process.1:hsa05223:Non-small cell lung cancer;2:hsa05221:Acute myeloid leukemia;3:hsa05220:Chronic myeloid leukemia;4:hsa05215:Prostate cancer;5:hsa05214:Glioma;6:hsa05213:Endometrial cancer;7:hsa05212:Pancreatic cancer;8:hsa05210:Colorectal cancer;9:hsa05200:Pathways in cancer;10:hsa04930:TypeⅡ diabetes mellitus;11:hsa04916:Melanogenesis;12:hsa04910:Insulin signaling pathway;13:hsa04722:Neurotrophin signaling pathway;14:hsa04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis;15:hsa04510:Focal adhesion;16:hsa04360:Axon guidance;17:hsa04310:Wnt signaling pathway;18:hsa04144:Endocytosis;19:hsa04012:ErbB signaling pathway;20:hsa04010:MAPK signaling pathway

Fig 5 The KEGG pathway network influenced by DEmiRNA of drug combinations

The color: red stands for the special target genes of drug combination; blue stands for non-target genes. The shape: diamond stands for the common targets under different treatments; hexagon stands for the common targets under two single drugs; rectangle stands for the common targets under berberine and combination; the circle stands for the special targets under combination; the triangl stands for the special targets under berberine.

由用藥后，miRNA的調控水平來看，黃連素作用后，miRNA的表達都是下調，吳茱萸堿作用后，miRNA的表達主要是上調，但是兩藥合用后miRNA的表達都是下調，并不等于兩藥聯合作用后miRNA的表達之和，有的甚至還會低于黃連素作用后miRNA的下調水平，原因可能是兩藥合用產生的協同效果，使得作用效果變強。

3 結論

本文從黃連素和吳茱萸堿單用及合用后影響的miRNA及對應的靶基因，結合生物學過程和KEGG通路，整合出藥物影響的KEGG通路網絡，從生物信息學角度系統地解析黃連素和吳茱萸堿協同作用的生物學機制。本文發現，黃連素和吳茱萸堿合用影響的特異靶基因既涵蓋了通路上游細胞膜上的3類膜受體，又參與到下游信號通路的轉導。通路上游全部由兩藥合用影響的特異靶基因靶向，并且合用使得調控這些靶基因的miRNA的表達都明顯下調。單用和合用共同的靶基因中，黃連素和吳茱萸堿單用分別主要使得調控這些靶基因的miRNA的表達下調和上調，而合用使得調控這些靶基因的miRNA的表達下調，說明黃連素在兩藥合用中起到的干擾作用更大或更廣泛，可能起到了主要作用。先前關于藥物協同機制的研究大都基于基因及蛋白水平。黃連素和吳茱萸堿在miRNA水平上協同機制的發現，提示我們在今后挖掘藥物協同機制時，不僅要從基因和蛋白水平，更要結合miRNA的調控水平等多維角度聯合分析，為今后協同藥物組合的發現提供了新的思路。

(致謝:本研究論文在同濟大學生命科學與技術學院曹志偉教授課題組完成。感謝課題組老師和同學的盡心協助。)

[1] Mullard A. 2015 FDA drug approvals[J].NatRevDrugDiscov,2016,15(2): 73-6.

[2] 彭 軍.抗腫瘤藥物聯合化療新進展[J].中國醫院藥學雜志,2003,23(12): 754-6.

[2] Peng J. The new development of combination of anti-tumor drug and chemotherapy[J].ChinJHospitPharm,2003,23(12): 754-6.

[3] Al-Lazikani B, Banerji U, Workman P. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era[J].NatBiotechnol, 2012,30(7): 679-92.

[4] 王佳藝,何俊勁,郝靜超,等.多肽AP25 與多西他賽聯合用藥對人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制活性研究[J].中國藥理學通報,2015,31(9): 1233-8.

[4] Wang J Y, He J J, Hao J C, et al.Combination of polypeptide AP25 and docetaxel in the treatment of breast cancer[J].ChinPharmacolBull,2015,31(9):1233-8.

[5] 陳 虹,張閃閃,董錦蕾,等.紫檀茋和乙酰紫草素抑制B16F10細胞增殖的協同作用[J].中國藥理學通報,2016,32(6): 818-24.

[5] Chen H, Zhang S S, Dong J L, et al. The synergistic antiproliferative effect of pterostilbene and acetylshikonin on B16F10 cells[J].ChinPharmacolBull, 2016, 32(6): 818-24.

[6] Jia J, Zhu F, Ma X, et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives[J].NatRevDrugDiscov,2009,8(2):111-28.

[7] Garofalo M, Condorelli G,Croce C M. MicroRNAs in diseases and drug response[J].CurrOpinPharmacol,2008,8(5): 661-7.

[8] Cuperus J T, Fahlgren N, Carrington J C. Evolution and functional diversification of MIRNA genes[J].PlantCell,2011,23(2): 431-42.

[9] Chen L, Lu M H, Zhang D, et al. miR-1207-5p and miR-1266 suppress gastric cancer growth and invasion by targeting telomerase reverse transcriptase[J].CellDeathDis,2014,5(1):e1034.

[10]Tang J, Feng Y, Tsao S, et al. Berberine and Coptidis rhizoma as novel antineoplastic agents: a review of traditional use and biomedical investigations[J].JEthnopharmacol,2009,126(1): 5-17.

[11]Shi H L, Wu X J, Liu Y, et al. Berberine counteracts enhanced IL-8 expression of AGS cells induced by evodiamine[J].LifeSci, 2013, 93(22): 830-9.

[12]Chou T C, Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J].PharmacolRev, 2006, 58(3):621-81.

[13]Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, et al. Exosomal miRNAs from peritoneum lavage fluid as potential prognostic biomarkers of peritoneal metastasis in gastric cancer[J].PLoSOne,2015,10(7): e0130472.

[14]Jiang L, Chang J, Zhang Q, et al. MicroRNA hsa-miR-125a-3p activates p53 and induces apoptosis in lung cancer cells[J].CancerInvest,2013,31(8):538-44.

[15]Wan Z Y, Tian J S, Tan H W, et al. Mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) is an essential mediator of metabolic and mitogenic effects of FGF19 in hepatoma cells[J].Hepatology,2016,64(4):1289-1301.

[16]Zhang Y, Zheng Y, Faheem A, et al.A novel AKT inhibitor,AZD5363,inhibits phosphorylation of AKT downstream molecules, and activates phosphorylation of mTOR and SMG-1 dependent on the liver cancer cell type[J].OncolLett,2016,11(3): 1685-92.

[17]Lu L L, Sun J, Lai J J, et al. Neuron-glial antigen 2 overexpression in hepatocellular carcinoma predicts poor prognosis[J].WorldJGastroenterol,2015,21(21): 6649-59.

[18]Amit M, Na′ara S,Gil Z. Mechanisms of cancer dissemination along nerves[J].NatRevCancer,2016,16(6):399-408.

[19]Petrick J L, Braunlin M, Laversanne M, et al. International trends in liver cancer incidence, overall and by histologic subtype, 1978-2007[J].IntJCancer,2016,139(7):1534-45.

[20]Hamam R, Ali A M, Alsaleh K A, et al. microRNA expression profiling on individual breast cancer patients identifies novel panel of circulating microRNA for early detection[J].SciRep,2016,6: 25997.

[21]Zhang W G, Li C F, Liu M, et al. Aquaporin 9 is down-regulated in hepatocellular carcinoma and its over-expression suppresses hepatoma cell invasion through inhibiting epithelial-to-mesenchymal transition[J].CancerLett,2016,378(2): 111-9.

[22]Zhao H, Halicka H D, Li J, et al. Berberine suppresses gero-conversion from cell cycle arrest to senescence[J].Aging(AlbanyNY), 2013,5(8): 623-36.

[23]Kleihues P. Erwin G. Van Meir (ed): CNS cancer:models, markers, prognostic factors, targets, and therapeutic approaches. J Neurooncol, 2010,98(3):435-6.

[24]Youm I, Bazzil J D, Otto J W, et al. Influence of surface chemistry on cytotoxicity and cellular uptake of nanocapsules in breast cancer and phagocytic cells[J].AAPSJ,2014,16(3): 550-67.

[25]Dahan A, Beig A, Lindley D, et al. The solubility-permeability interplay and oral drug formulation design: Two heads are better than one[J].AdvDrugDelivRev,2016,101(6):99-107.

Study of synergistic mechanism in the combination of berberine and evodiamine from the perspective of miRNA

YIN Zuo-jing,CAO Zhi-wei,YAN Xin-miao,YANG Yi-yan,SHENG Zhen

(SchoolofLifeScienceandTechnology,TongjiUniversity,Shanghai200092,China)

Aim To explore the mechanisms of action (MOA) of synergistic anticancer function in the combination of berberine and evodiamine. Methods We first analyzed the action of suppression in the drug combination from the cell level and validated the dose scope as well as ratio of concentration in synergistic effects of drug combination. Then, the miRNA chip of liver cancer cell BEL-7402 under different treatment was analyzed. By building the miRNA-mRNA network, the MOA of the synergistic drug combination was illustrated. Results Berberine and evodiamine used in combination could significantly synergistically suppress the proliferative ability of liver cancer cells. The special differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) mainly participated in some cancer proliferation-related pathways and biological processes, such as MAPK signaling pathway, endocytosis pathway and insulin signaling pathway. The special target genes influenced by the drug combination not only covered three kinds of membrane receptors, but also took part in the regulation of downstream pathways. Conclusions From the regulation of miRNAs, it is clear that berberine may play a primary role in the synergistical suppression activity of the drug combination in cancer cells. The discovery of synergistic MOA in the combination of berberine and evodiamine from the miRNA level will provide a new guidance to explore more synergistic drug combinations in the future.

berberine; evodiamine; drug combination; synergistic drug combination; mechanisms of action; KEGG pathway; pathway network

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.016.html

2017-01-19,

2017-02-27

國家高等科技研究與發展基金(863項目)資助項目(No 2012AA020405)；衛生部資助基金項目(No 2012ZX10005001)

尹作靜(1990-)，女，碩士生，研究方向：生物信息學，E-mail：bioyin@126.com; 盛 振(1988-)，男，博士，研究方向：生物信息學，通訊作者，E-mail：shengzhen@live.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.008

A

1001-1978(2017)06-0772-09

R284.1；R329.24；R342.2；R735.705.31；R979.1