CMPK1蛋白與阿霉素引起的多藥耐藥的相關性研究

陳淑嫻，葉向暉，王 敘，金 堅

(江南大學藥學院 藥物設計與分子藥理研究室，江蘇 無錫 214122)

CMPK1蛋白與阿霉素引起的多藥耐藥的相關性研究

陳淑嫻，葉向暉，王 敘，金 堅

(江南大學藥學院 藥物設計與分子藥理研究室，江蘇 無錫 214122)

阿霉素；IC50；藥敏性；多藥耐藥；CMPK1;紫杉醇;吉西他濱

多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)是在藥物治療的過程中，經一種藥物的誘發導致細胞對其他結構和功能各異的藥物也產生耐藥的現象，具廣譜耐藥特性[1]。腫瘤細胞的MDR嚴重影響了臨床療效及患者預后，是引發化療失敗的主要原因[2]。MDR的機制較為復雜，單一靶點的抗腫瘤藥物極易產生耐藥[3]，蒽環類化合物阿霉素(Adriamycin, ADM)雖自20世紀70年代進入臨床使用以來就迅速成為乳腺癌一線使用藥物，并被美國FDA認為最有效的化療藥物之一[4-5]，但近些年日趨嚴重的MDR現象嚴重制約了其作為臨床一線用藥的使用，相較于MDR逆轉劑的研究，對MDR具體機制的探究則更為迫切。我們此前首次應用含17 000種蛋白的芯片對阿霉素的作用靶點進行了研究，初步篩選出了14個阿霉素可能的作用靶點。針對近些年出現的阿霉素耐藥現象，本文著重篩選阿霉素耐藥相關蛋白并加以解析。

CMPK1定位于細胞質，以ATP為磷酸供體，將單磷酸胞苷酸(CMP)、尿苷酸(UMP)和脫氧胞苷酸[(d)CMP]磷酸化為對應的雙磷酸胞苷酸(CDP)、尿苷酸(UDP)和脫氧胞苷酸[(d)CDP]，為胞內的核酸合成提供前體物質，在細胞中起著重要的作用[6]。同時，CMPK1還可以有效激活脫氧胞苷酸類似物的活性，這些脫氧胞苷酸類似物可被用于抑制腫瘤或抗病毒方面的治療，包括吉西他濱被用于胰腺癌等實體瘤、Ara-C被用于惡性血液??；并且ddC，3-TC可有效地抗自身免疫性病毒及乙肝病毒[7]。CMPK1是非小細胞肺癌和吉西他濱相關化療方案預后因子[8-9]。在三陰性乳腺癌中CMPK1的細胞核定位可提示治療的不良預后[10]。CMPK1與ADM的關系還未被研究過，本文著重探究CMPK1蛋白與阿霉素耐藥的關系，并解析CMPK1低表達引發細胞阿霉素耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293細胞、MCF7細胞均引自中科院上海細胞庫，MCF7/ADM細胞為筆者實驗室建株。質粒、CMPK1抗體均來源于Origen公司。羊抗鼠辣根過氧化酶標記二抗為Proteintech公司產品。DMEM高糖培養基、胎牛血清、Lipo2000脂質體轉染試劑均為Invitrogen公司產品。胰酶/EDTA、雙抗均為吉諾公司產品。Cell-Titer Blue細胞活性檢測試劑為Promega公司產品。CMPK1 siRNA為Santa Cruz公司產品。阿霉素購自大連美侖，紫杉醇購自紅豆杉藥業，吉西他濱為MedChem Express公司產品。RIPA裂解液購自碧云天。ECL顯色試劑盒為七海生物公司產品。RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒為TaKaRa公司產品。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞均培養于含有10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1鏈霉素的DMEM完全培養基中，MCF7細胞及MCF7/ADM細胞培養時補加終濃度2 kU·L-1的胰島素，放置于37℃，5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱(Thermo Forma公司)培養。細胞傳代時使用0.25%胰酶/EDTA。

1.2.2 質粒及siRNA轉染 細胞常規培養至匯合度達80%～90%，胰酶消化收集細胞，每皿5×106加到10 cm細胞培養皿中，按照Lipo 2000脂質體轉染試劑的說明書進行轉染，18～40 h后進行后續試驗。

1.2.3 IC50檢測 參照馬曉峰等[11]，消化收集細胞，調整細胞濃度，按照5 000～8 000/孔接種于96孔細胞板。將待測藥物進行倍比稀釋，吸除96孔板中的培養基，將稀釋好的藥物按照每個濃度3個復孔加入到96孔板內，每孔100 μL，放置細胞培養箱正常培養48 h，取出96孔板，每孔加入10 μL CellTiter Blue試劑，繼續放置于培養箱正常培養1～4 h，取出96孔板于酶標儀檢測每孔熒光值IF(Excitation:560 nm;Emission:590 nm)，按以下公式計算細胞活力，Graph Pad 5.0作圖進行IC50分析。

1.2.4 RT-PCR檢測基因表達 按照試劑盒要求操作，提取細胞RNA，NanoDrop 2000(Thermo Scientific公司)檢測RNA濃度和純度，10%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，PCR擴增序列見Tab 1。PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳，紫外燈凝膠成像系統拍照，Image J分析各PCR條帶灰度值，Graph Pad軟件作圖分析。

1.2.5 Western blot (WB)檢測蛋白表達 胰酶消化收集細胞，并用PBS離心法洗滌3次，每次3 min，500×g，4℃。向細胞沉淀內加入RIPA后混勻并置于冰上裂解10 min，12 000×g離心15 min，取上清，NanoDrop 2 000檢測蛋白濃度后將蛋白用RIPA調整至相同濃度，加入上樣緩沖液于100℃熱變性5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，取出凝膠，按照順序放置凝膠及PVDF膜后調整電壓(100 V)及時間(60 min)，轉膜后取出PVDF膜，加入封閉液(5%脫脂奶粉：TBS配制)封閉1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，加入一抗4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗37℃孵育1 h，按照ECL顯色說明書要求進行顯色，于成像儀進行拍照。Image J分析各條帶灰度值，Graph Pad軟件作圖分析。

Tab 1 Primer for 14 genes of protein candidates and β-actin gene

1.3 統計學處理 采用Graph Pad軟件進行組間t檢驗。

2 結果

2.1 質粒轉染后細胞藥敏性檢測 Fig 1是分別轉染14種質粒的HEK293細胞以及未轉染的HEK293細胞對阿霉素的IC50，由圖可見，與野生型細胞相比，轉染后IC50增加的有：DYNLL1和COX6B2；轉染后IC50降低的有：TNFAIP6、APOA2、TRMT112、MGAT1、COASY、CMPK1、CLIC1、DVL2。轉染后細胞的IC50增加的程度較低，與對照組的比值均在2以內，而轉染后IC50減少的細胞中，CMPK1過表達的細胞IC50最低，IC50HEK293-CMPK1/IC50HEK293-Control=0.15,P<0.01。提示作為轉染后IC50變化最大的表達蛋白，CMPK1與細胞耐藥相關的可能性較大，CMPK1高表達細胞對藥物的耐受性降低，藥敏性提高。

2.2 RT-PCR檢測CMPK1基因表達 實驗室人乳腺癌阿霉素耐藥細胞MCF7/ADM是張蓮芬等[12]建立的。RT-PCR對人乳腺癌親本細胞MCF7和阿霉素耐藥細胞MCF7/ADM內的14種相關基因進行分析，耐藥細胞MCF7/ADM細胞中的CMPK1基因表達低于親本細胞MCF7(P<0.05)。

Fig 1 IC50 assay of overexpression HEK293 cells to ADM

1：Control;2:TNF AIP6;3:APOA2;4:DYNLL1;5:TRMT112;6:MGAT1;7:SLC22A6;8:COASY;9:CMPK1;10:COX6B2;11:CLIC2;12:DVL2;13:ZNF684;14:TRDMT1;15:H3F3B.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 RT-PCR assay of gene expression in MCF7 cells and MCF7/ADM cells

ρ,means the expression of certain gene over β-actin gene.1:TNFAIF6;2:APOA2;3:DYNLL1;4:TRMT112;5:MGAT1;6:SLC22A6;7:COASY;8:CMPK1;9:COX6B2;10:CLIC2;11:DVL2;12:H3F3B;13:TRDMT1;14:ZNF684.*P<0.05,**P<0.01vsMCF7

2.3 WB檢測CMPK1蛋白表達 Fig 3顯示人乳腺癌耐藥細胞MCF7/ADM中CMPK1蛋白的表達水平低于親本MCF7細胞(P<0.01)，CMPK1蛋白的表達在耐藥細胞中有所降低，CMPK1表達的降低可能與細胞耐藥相關。

2.4 CMPK1 siRNA作用后藥敏性變化 MCF7細胞轉染CMPK1 siRNA后，CMPK1蛋白表達水平下降(Fig 4)，細胞對阿霉素的IC50增加：IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=4.8,P<0.05，且CMPK1低表達的細胞對紫杉醇(IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.6)、吉西他濱(IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.5)的IC50也增加，P<0.05(Tab 2)，表明CMPK1表達水平降低的同時，也降低了細胞對多種化療藥物的藥敏性。細胞對藥物的耐受性增加。

Fig 3 WB assay of CMPK1 expression in MCF7 cells and MCF7/ADM cells

**P<0.01vscontrol

Fig 4 Expression of CMPK1 in CMPK1 siRNA transfected MCF7 cells and non-transfected control

**P<0.01vscontrol

Tab 2 IC50 assays of CMPK1 siRNA transfected MCF cells and non-transfected control MCF7 cells

σ,means IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control,*P<0.05vscontrol

3 討論

目前已經發現的與阿霉素引起的多藥耐藥相關的主要是ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白家族，轉運蛋白家族主要包括P糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白等[13]。多藥耐藥細胞還表現出失巢凋亡(Anoikis)逃避現象[14]。藥物在胞內的再修飾作用也與耐藥相關，譬如參與阿霉素代謝修飾的醛酮還原酶家族[15]及羰基還原酶家族[16]等，將阿霉素代謝為阿霉素醇，從而減弱了阿霉素本身插入DNA的功能，文獻表明阿霉素醇的毒性較阿霉素小了數10倍之多[17]，阿霉素耐藥細胞中這些酶的表達要遠高于野生型細胞。

文中所用的14中質粒是此前實驗組在Origene公司17K蛋白芯片[18]上的陽性篩選結果對應的質粒，前期實驗表明該14種質粒表達的蛋白皆為阿霉素在細胞內可能的作用靶點，阿霉素引起的耐藥已經引起眾多研究者的注意并迫切需要解決，本文暫從細胞耐藥方面考慮，從14個可能的結合位點中篩選阿霉素耐藥相關蛋白。HEK293細胞的轉染效率比較高，可以達到80%～90%。在不考慮質粒個體轉染差異的前提下，我們選取了IC50變化最大的表達蛋白CMPK1作為研究對象。

文中藥敏性檢測結果表明CMPK1蛋白表達的增加提高了阿霉素的藥敏性。Réjiba等[19]還發現CMPK1蛋白表達的增加亦可提高吉西他濱、氟尿嘧啶等核苷類似物的藥敏性，并且Humeniuk等[20]發現氟尿嘧啶耐藥細胞及吉西他濱耐藥細胞中CMPK1的蛋白表達均有所下降，而本文阿霉素耐藥細胞中CMPK1的蛋白表達亦有所下降，RT-PCR結果還表明耐藥細胞的CMPK1基因表達降低。本文所用的阿霉素非核苷類似物，阿霉素耐藥細胞中CMPK1蛋白含量的變化由因化療藥阿霉素引起，因而可以推斷化療藥物阿霉素可能引發細胞內CMPK1蛋白含量的降低，進而引起細胞對多種藥物的耐藥，包括核苷類似物、紫杉醇類似物等的耐藥。

CMPK包括CMPK1和CMPK2，CMPK2主要分布于線粒體[21]，因而研究較多的為CMPK1，核苷類似物與CMPK1耐藥的關系是由于CMPK1對核苷類似物的激活作用，因而其含量的變化與藥物的效能密切相關。筆者對與CMPK1激酶作用后的ADM進行HPLC及LC/MS分析，研究表明與CMPK1作用后ADM本身的結構未發生變化或修飾，而是CMPK1的活性在ADM存在的情況下有所激活，因此我們猜測ADM耐藥細胞導致CMPK1表達量的降低可能是由于ADM的持續使用而導致細胞內CMPK1活性的持續增加，而機體需要的CMPK1發揮的活性的量是一定的，細胞機體因此進行反饋調節，因而減少了CMPK1在蛋白水平的表達，進而又影響到ADM及其他藥物的藥敏性。研究又表明CMPK1可能與細胞外基質的紊亂及細胞周期的失調相關[10]，紫杉烷類主要是影響細胞微管及微絲的聚合，影響細胞周期，因而CMPK1的變化引發紫杉醇的耐藥可能與此相關。

簡言之，CMPK1的表達與細胞對阿霉素的藥敏性呈正相關，并可能因此引起紫杉烷類及核苷類似物的耐藥。

(致謝：感謝前期Origen technology公司提供的蛋白芯片及技術支持，再此表示由衷的感謝。)

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Relationship between CMPK1 protein and ADM caused multidrug resistance

CHEN Shu-xian,YE Xiang-hui， WANG Xu， JIN Jian

(LaboratoryofdrugdesignandMolecularPharmacology，SchoolofMedicineandPharmaceutics，JiangnanUniversity，WuxiJiangsu214122，China)

Aim To assay the possible targets of adriamycin (ADM), screening ADM resistance related proteins. Methods The drug sensitivity of the cells was analyzed by IC50assay; RT-PCR assay was used to detect the expression of genes in the cells; CMPK1 protein expression was tested by Western blot assay; the expression of CMPK1 in the cells was decreased by siRNA of CMPK1. Results Data from IC50assay showed the sensitivity of cells transfected with CMPK1 was increased most(IC50HEK293-CMPK /IC50HEK293-Control=0.15,P<0.01), and the expression of CMPK1 protein in ADM resistant breast cells (MCF7/ADM) was lower than that in parent MCF7 cells (P<0.05). When the expression level of CMPK1 was decreased by CMPK1 siRNA, the sensitivity of MCF7 cells to ADM decreased (IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.6,P< 0.01), and the sensitivity of MCF7 cells to paclitaxel and gemcitabine also decreased. Conclusions CMPK1 was related to the multidrug resistance of cells, and the expression of CMPK1 was positively related to the sensitivity to drugs, which provides the possibility of CMPK1 as a target in the treatment of multidrug resistance.

adriamycin; IC50; drug sensitivity; CMPK1; paclitaxel; gemcitabine

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.020.html

2017-01-10,

2017-03-01

國家自然科學基金國際(地區)合作與交流項目(No 81361168001)；江蘇省臨床醫學科技專項(No BL 2014019)

陳淑嫻(1986-)，女，博士，研究方向：藥物設計與分子藥理學，E-mail：csx.ss@163.com； 金 堅(1960-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：藥物設計與分子藥理學，通訊作者，E-mail：jinjian31@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.010

A

1001-1978(2017)06-0788-05

R329.24；R394.2；R737.902.2；R737.905.3；R979.1；R977.6摘要：目的 對阿霉素可能的作用靶點進行分析，篩選阿霉素耐藥相關蛋白。方法 質粒轉染HEK239細胞以構建蛋白高表達模型；IC50檢測細胞的藥敏性；RT-PCR檢測細胞內基因的表達；Western blot檢測CMPK1蛋白的表達；CMPK1 siRNA構建CMPK1蛋白低表達模型。結果 IC50檢測結果表明高表達CMPK1蛋白的細胞對阿霉素的敏感性增加程度最大(IC50HEK293-CMPK1/IC50HEK293-Control=0.15,P<0.01)，且阿霉素耐藥細胞(MCF7/ADM)中CMPK1蛋白的表達低于乳腺癌親本細胞MCF7(P<0.05)。MCF7細胞中，CMPK1蛋白表達水平經CMPK1 siRNA下調之后，對阿霉素的藥敏性隨之降低 (IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.6,P<0.01)，且對紫杉醇、吉西他濱的藥敏性也隨之降低。結論 CMPK1與細胞的多藥耐藥相關，且CMPK1蛋白的表達與藥敏性呈正相關，提示了CMPK1作為多藥耐藥治療靶點的可能性。