黃蜀葵花中5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)腸道L細(xì)胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

蔡紅蝶，宿樹(shù)蘭，陶偉偉,2，朱 悅，郭建明，錢(qián)大瑋，段金廒,3

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室， 2.平移系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)中心/腦疾病綜合生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3.中藥品質(zhì)與效能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，江蘇 南京 210023)

黃蜀葵花中5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)腸道L細(xì)胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

蔡紅蝶1，宿樹(shù)蘭1，陶偉偉1,2，朱 悅1，郭建明1，錢(qián)大瑋1，段金廒1,3

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室， 2.平移系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)中心/腦疾病綜合生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3.中藥品質(zhì)與效能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，江蘇 南京 210023)

錦葵科；黃屬葵花；腸道L細(xì)胞；AGEs；RAGE；黃酮類(lèi)化合物

黃蜀葵[Abelmoschusmanihot(L.)Medicus]為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵的花，始載于《嘉佑本草》，后收錄于《本草綱目》。其味甘、辛；性涼。歸心、腎、膀胱經(jīng)。具有利尿通淋、活血、止血、消腫解毒的功效，主淋證、吐血、衄血、崩漏、胎衣不下、癰腫瘡毒、水火燙傷。現(xiàn)代藥理研究表明，黃蜀葵花具有各種明顯的生物活性，如消炎止痛、抗氧化、抗凝血、抗心肌缺血壞死、保護(hù)缺血性腦損傷、延緩腎小管損害和腎纖維化、降低血糖、促進(jìn)血管生成等[1-5]。臨床上主要用來(lái)治療慢性腎臟疾病，如黃葵膠囊。化學(xué)成分研究表明，黃蜀葵花中主要含有黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾類(lèi)及揮發(fā)性成分，其中黃酮類(lèi)成分為主要活性成分，主要包括槲皮素、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O′-葡萄糖醛酸苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷。據(jù)報(bào)道，槲皮素對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠[6]、尿酸性腎病大鼠[7]、高尿酸血癥小鼠[8]、神經(jīng)細(xì)胞[9]及癌細(xì)胞[10]等具有明顯的作用。金絲桃苷與異槲皮苷具有降血脂、保肝、保護(hù)心腦血管、抗炎、抗抑郁、保護(hù)神經(jīng)等各種藥理作用[11-16]。槲皮素-3-O′-葡萄糖醛酸苷及棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷被報(bào)道具有明顯調(diào)節(jié)胰島素抵抗的藥理活性[17]。本文通過(guò)研究以上5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)腸道L細(xì)胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，為黃屬葵花資源的進(jìn)一步利用與開(kāi)發(fā)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 腸道L細(xì)胞系GLUTag細(xì)胞購(gòu)自于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要試劑與耗材 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó) FALCON 353014)；Penicillin/streptomycin solution(中國(guó)，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGY002)；0.25% Tripsin-EDTA(中國(guó)，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGY001)；PBS(中國(guó)，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGB500)；DMEM(美國(guó)，Gibco，12800-082)；F12(美國(guó)，Gibco，883684)；FBS(美國(guó)，ExCell Biology，F(xiàn)BS500)；6 wellcell culture plate(美國(guó)，Corning Incorporated，3516)；Bax、caspase-3、caspase-9、gp22phox、NFKB-P65、p38MAPK、p53、RAGE、p47phox、β-actin等抗體購(gòu)自于美國(guó)劍橋Abcam公司；IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；槲皮素(QT)、異槲皮苷(IQT)、金絲桃苷(HY)、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷(QG)、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷(GG)由實(shí)驗(yàn)室從黃蜀葵花中制備，純度高于95%。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)(中國(guó)，蘇州凈化，SW-CJ-1FD)；CO2培養(yǎng)箱(日本，SANYO，XD-101)；生物倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS，IX51)；臺(tái)式低速離心機(jī)(中國(guó)，上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)，80-2)；恒溫水浴箱(常州國(guó)華電器有限公司，HH-4)；電熱恒溫干燥箱(上海潤(rùn)東榮豐科學(xué)儀器有限公司，101-AS-3)。

1.2 方法

1.2.1 GLUTag細(xì)胞培養(yǎng) 以含10%的FBS、100 kU·L-1青霉素、100 g·L-1鏈霉素的DMEM 低糖培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，每2 d更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，消化傳代。

1.2.2 AGEs制備 稱(chēng)量一定量的BSA與葡萄糖溶于pH為7.4的PBS中，混勻，配制濃度為20 g·L-1的BSA與500 mmol·L-1的葡萄糖，并加入終濃度為0.5 mmol·L-1的EDTA，室溫放置過(guò)夜。0.2 μmol·L-1濾器過(guò)濾除菌，封口后放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育90 d。對(duì)照組BSA不加葡萄糖，其他制備方法與以上步驟相同。熒光光譜掃描檢測(cè)制備的BSA-AGEs(激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 用96孔板鋪板細(xì)胞，用DMEM低糖培養(yǎng)基預(yù)處理，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)6 h，使其處于同步化狀態(tài)，每24 h換液，實(shí)驗(yàn)分為7組：空白對(duì)照組(NG)、模型組(AGEs)、槲皮素組(QT)、異槲皮苷組(IQT)、金絲桃苷組(HY)、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷組(QG)、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷組(GG)。NG細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM低糖培養(yǎng)基中，不添加其它任何干預(yù)因素；AGEs細(xì)胞培養(yǎng)于含200 mg·L-1AGEs的DMEM低糖培養(yǎng)基中；給藥組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含50 μmol·L-1各黃酮單體及含200 mg·L-1AGEs的DMEM低糖培養(yǎng)基中。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)RAGE、p22Phox、p47Phox、p53、Bax蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測(cè)以β-actin為內(nèi)參。收集各組處理的細(xì)胞，用PBS清洗3次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，用二辛可寧酸(BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。配制10%分離膠和5%濃縮膠，60 mA預(yù)電泳15 min，蛋白上樣(20 mg)，SDS-PAGE轉(zhuǎn)電泳2.5 h后，在含有封閉液的平皿中于室溫下封閉1 h。分別加入RAGE、p22Phox、p47Phox、p53、Bax、Phospho-p38MAPK、NF-κB一抗4 ℃過(guò)夜，Tris緩沖液清洗3次，接著加入二抗37 ℃孵育1 h，最后Tris緩沖液清洗3次。用 X光片曝光、顯影、定影。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)caspase-3、caspase-9的活性 各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，加入胰酶消化細(xì)胞，4 ℃, 800 r·min-1離心5 min。棄上清，取細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌3次，然后將細(xì)胞移入無(wú)菌1.5 mL EP管，3 000 r·min-1離心5 min。棄去上清，加50 μL細(xì)胞裂解液于每管中。冰浴10 min使細(xì)胞重懸。4 ℃，10 000 r·min-1離心5 min，將上清移至另一潔凈的EP管中。每管加入2×Reaction Buffer/DTTMix 50 μL及DEVD-fmk 1 mL，冰浴30 min。然后分別加入5 μL 1 mmol·L-1Ac-DEVD-pNA, Ac-VDVAD-pNA, Ac-LEHD-pNA于每孔中，室溫放置2h后移至96孔培養(yǎng)板。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量OD值，波長(zhǎng)設(shè)置為405 nm。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1、IL-6的含量 各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同因素干預(yù)后孵育24 h，取各組細(xì)胞的上清液，詳細(xì)操作步驟按照TNF-α、IL-1、IL-6的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定，利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀量OD值。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)各組GLUTag細(xì)胞RAGE蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，Western blot測(cè)定各組GLUTag細(xì)胞的RAGE蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如Fig 1所示。各組細(xì)胞中RAGE蛋白表達(dá)水平差異有顯著性(P<0.01)，200 mg·L-1AGEs作用GLUTag細(xì)胞24 h后，RAGE蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)50 μmol·L-1QT、IQT、HY、QG、GG干預(yù)后，RAGE蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)。其中以HY作用最為明顯，結(jié)果表明黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分可有效抑制RAGE蛋白的過(guò)度表達(dá)。

Fig 1 Espression of RAGE in GLUTag cells from different groups tested by Western blot(intervention for 24 h)

*P<0.05,**P<0.01vsAGEs;##P<0.05vsNG

2.2 Western blot檢測(cè)各組GLUTag細(xì)胞中NADPH氧化酶亞單位蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，Western blot測(cè)定各組GLUTag細(xì)胞的p22Phox、p47Phox蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如Fig 2所示。各組細(xì)胞中p22Phox、p47Phox蛋白表達(dá)水平差異有顯著性(P<0.01)，200 mg·L-1AGEs作用GLUTag細(xì)胞24 h后，p22Phox、p47Phox蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)50 μmol·L-1QT、IQT、HY、QG、GG干預(yù)后，p22Phox、p47Phox蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)。其中以金絲桃苷組最接近正常組，結(jié)果表明黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分可有效抑制NADPH氧化酶亞單位蛋白的過(guò)度表達(dá)。

Fig 2 Expressions of p22Phox,p47Phox in GLUTag cells from different groups detected by Western blot(intervention for 24 h)

*P<0.05,**P<0.01vsAGEs;##P<0.05vsNG

2.3 Western blot檢測(cè)各組GLUTag細(xì)胞中p53、Bax蛋白的表達(dá)水平 各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，Western blot測(cè)定各組GLUTag細(xì)胞的p53、Bax蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如Fig 3所示。各組細(xì)胞中p53、Bax蛋白表達(dá)水平差異有顯著性(P<0.01)，200 mg·L-1AGEs作用GLUTag細(xì)胞24 h后，Bax蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，p53蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)50 μmol·L-1QT、IQT、HY、QG、GG干預(yù)后，p53、Bax蛋白表達(dá)水平均向正常組靠近。其中以金絲桃苷組最趨近于正常組，結(jié)果表明黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分可有效調(diào)節(jié)GLUTag細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax的表達(dá)。

Fig 3 Espressions of p53,Bax in GLUTag cells from different groups detected by western blot(intervention for 24 h)

*P<0.05,**P<0.01vsAGEs;##P<0.05vsNG.

2.4 ELISA檢測(cè)GLUTag細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-3、caspase-9活性 各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，ELISA檢測(cè)各組GLUTag細(xì)胞中caspase-3、caspase-9的活性，結(jié)果如Fig 4所示。各組細(xì)胞中caspase-3、caspase-9的活性差異有顯著性(P<0.01)，200 mg·L-1AGEs作用GLUTag細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中caspase-3、caspase-9的活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)50 μmol·L-1QT、IQT、HY、QG、GG干預(yù)后，caspase-3、caspase-9的活性均向正常組回調(diào)。其中HY的調(diào)節(jié)作用最為明顯，結(jié)果表明黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分可有效抑制GLUTag細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶caspase-3、caspase-9的活性。

Fig 4 Effect of flavonoids and AGEs on caspase-3 and caspase-9 activity in GLUTag cells

*P<0.05,**P<0.01vsAGEs;##P<0.05vsNG

2.5 Western blot檢測(cè)各組GLUTag細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平、NF-κB的表達(dá)水平 各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，Western blot檢測(cè)各組GLUTag細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平、NF-κB的表達(dá)水平，結(jié)果如Fig 5所示。各組細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平及NF-κB的表達(dá)水平差異有顯著性(P<0.01)，200 mg·L-1AGEs作用GLUTag細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平及NF-κB的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)50 μmol·L-1QT、IQT、HY、QG、GG干預(yù)后，p38MAPK磷酸化水平及NF-κB的表達(dá)水平均接近正常組。結(jié)果表明黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分可有效抑制AGEs刺激的GLUTag細(xì)胞中p38MAPK的磷酸化及NF-κB的過(guò)表達(dá)。

2.6 ELISA檢測(cè)GLUTag細(xì)胞上清液中炎癥因子的含量 各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，ELISA試劑盒測(cè)定各組GLUTag細(xì)胞中TNF-α、IL-1、IL-6的含量，結(jié)果如Fig 6所示。200 mg·L-1AGEs作用24 h后，模型組GLUTag細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的分泌量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)50 μmol·L-1QT、IQT、HY、QG、GG干預(yù)24 h后，TNF-α、IL-1、IL-6的分泌量與模型組比較明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中以QT的調(diào)節(jié)作用最為明顯，結(jié)果表明，黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分可有效抑制AGEs刺激的GLUTag細(xì)胞分泌炎癥因子。

Fig 5 Expressions of p-p38MAPK and NF-κB in GLUTag cells from different groups detected by western blot(intervention for 24 h)

*P<0.05,**P<0.01vsAGEs;##P<0.05vsNG

3 討論

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種含有30個(gè)氨基酸的肽類(lèi)激素，為腸促胰素中的一種，在餐后食物刺激下，由分布在回腸與結(jié)腸段粘膜層的腸道L細(xì)胞即GLUTag細(xì)胞分泌，釋放進(jìn)入血液，與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，促進(jìn)胰島素分泌及抑制胰高血糖素分泌，以降低血糖。多項(xiàng)研究表明[18-20]，GLP-1分泌減少是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者腸促胰素效應(yīng)受損主要特點(diǎn)，而GLUTag細(xì)胞的早期凋亡則是GLP-1分泌減少的主要原因，并參與了T2DM的發(fā)生和發(fā)展。因此研究GLUTag細(xì)胞的早期凋亡機(jī)制及其作用藥物顯得格外重要。糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是長(zhǎng)期高血糖與多種蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化作用后，形成的具有毒性而不可逆的化合物，大量的不可逆的AGEs的產(chǎn)生和積聚是細(xì)胞損傷及DM慢性進(jìn)展的重要機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào)道[21]，AGEs能結(jié)合細(xì)胞膜上RAGE受體，活化內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶系統(tǒng)，激活細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)炎癥因子的釋放并影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9、p53、Bax的表達(dá)，導(dǎo)致GLUTag細(xì)胞炎癥損傷與凋亡。

Fig 6 Effect of flavonoids and AGEs on content of TNF-α,IL-1,IL-6 in GLUTag cells

*P<0.05,**P<0.01vsAGEs;##P<0.05vsNG

氧化應(yīng)激是指機(jī)體生成過(guò)量活性氧(ROS)，超過(guò)自身抗氧化能力時(shí)，便發(fā)揮細(xì)胞毒性作用使細(xì)胞損傷甚至凋亡。因此細(xì)胞內(nèi)ROS水平可在一定程度上反應(yīng)細(xì)胞氧化損傷狀態(tài)，而細(xì)胞內(nèi)ROS主要來(lái)源于由2個(gè)膜亞基gp91Phox、p22Phox及3個(gè)胞質(zhì)亞基p40Phox、p47Phox、p67Phox組成的NADPH氧化酶系統(tǒng)[22-23]。本研究參照文獻(xiàn)[21]，選擇200 mg·L-1AGEs刺激GLUTag細(xì)胞24 h后，采用Western blot檢測(cè)其受體RAGE的表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGEs處理后的GLUTag細(xì)胞中RAGE、p22Phox和p47Phox的表達(dá)水平明顯升高，而各黃酮單體給藥組的細(xì)胞內(nèi)RAGE、p22Phox和p47Phox的表達(dá)水平較AGEs模型組明顯下降，說(shuō)明AGEs可通過(guò)與RGEs結(jié)合后，引起GLUTag細(xì)胞中一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，而黃屬葵花中的黃酮類(lèi)成分可有效抑制此過(guò)程的發(fā)生與發(fā)展。

p38MAPK是MAPK家族中重要成員，是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)。它在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞的存活、分化和凋亡等過(guò)程[24-25]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄刺激因子，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。p38MAPK是NF-κB的重要上游激酶，ROS可通過(guò)直接激活p38MAPK[26]使其進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-κB活化，從而增強(qiáng)炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)，最終導(dǎo)致多細(xì)胞炎癥損傷[27-29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGEs處理GLUTag細(xì)胞后，p38MAPK磷酸化水平升高，激活NF-κB因子表達(dá)，釋放TNF-α、IL-1、IL-6，從而使腸道L細(xì)胞產(chǎn)生炎癥損傷。黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分干預(yù)后，細(xì)胞中各指標(biāo)均向正常回調(diào)，從而改善GLUTag細(xì)胞炎癥損傷。

細(xì)胞凋亡的主要細(xì)胞信號(hào)通路有caspase依賴(lài)的通路和非caspase依賴(lài)的通路。Caspase是一族結(jié)構(gòu)相似的特異性裂解天冬氨酸殘基的半胱氨酸蛋白酶，可通過(guò)死亡受體和線(xiàn)粒體通路的激活調(diào)控細(xì)胞的凋亡，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行期發(fā)揮關(guān)鍵作用[30]。在應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)凋亡通路中，p53表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一條常見(jiàn)通路[31-32]。GLUTag細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡可能是通過(guò)Bcl-2家族調(diào)節(jié)的，該家族包括凋亡分子如Bax和抗凋亡分子如Bcl-2，而這些分子是caspase的調(diào)節(jié)因子，另外caspase是多種類(lèi)型凋亡的終端效應(yīng)分子[33]。本部分實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與正常組細(xì)胞相比，AGEs刺激的GLUTag細(xì)胞中p53的表達(dá)明顯下調(diào)，Bax的表達(dá)及caspase-3、caspase-9的活性明顯上調(diào)，黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分干預(yù)后，細(xì)胞中各指標(biāo)均向正常回調(diào)。

綜上所述，本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AGEs作用于GLUTag細(xì)胞，可上調(diào)細(xì)胞RAGE受體表達(dá)，激活NADPH氧化酶，升高p38MAPK磷酸化水平，促使NF-κB因子表達(dá)，釋放炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6，并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9、p53、Bax的表達(dá)，從而導(dǎo)致GLUTag細(xì)胞炎癥損傷與凋亡，黃屬葵花中黃酮類(lèi)成分能顯著調(diào)節(jié)GLUTag細(xì)胞中AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝各位實(shí)驗(yàn)人員的付出。)

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Regulation of flavoniods fromAbelmoschusmanihoton AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB signal pathway in GLUTag cells

CAI Hong-die1,SU Shu-lan1,TAO Wei-wei1,2,ZHU Yue1,GUO Jian-ming1,QIAN Da-wei1,DUAN Jin-ao1,3

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,andNationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine,andKeyLaboratoryofChiesseMedicinalResourcesRecyclingUtilizationofStateAdministationofTranslationalChineseMedicine; 2.CenterforTranslationalSystemsBiologyandNeuroscience,LaboratoryofIntegrativeBiomedicineofBrainDiseases,SchoolofBasicBiomedicalScience;3.StateKeyLaboratoryCultivationBaseforTCMQualityandEfficacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Aim To investigate the regulation of five flavonoids fromAbelmoschlmanihoton the AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB signaling pathway in GLUTag cells. Methods With GLUTag cells treated with 200 mg·L-1AGEs,Western blot analysis was applied to determine the expression of RAGE, p22Phox, p47Phox, p53 and Bax proteins and ELISA analysis was used to detect the levels of TNF-α, IL-1, IL-6, caspase-3, caspase-9. The cells were divided into seven groups: the normal group(NG), model group(AGEs), quercetin-treated group(QT), isoquercitrin-treated group(IQT), hyperoside-treated group(HY), quercetin-3′-O-glucoside-treated group(QG), gossypetin-8-O-glucuronide-treated group(GG). NG cells were cultured in DMEM low-glucose culture medium without adding any other intervention factors; model group cells were cultured in DMEM low-glucose medium containing 200 mg·L-1AGEs; cells in five treatment groups were cultured in DMEM low-glucose culture medium containing 200 mg·L-1AGEs, which were respectively added 50 μmol·L-1QT, IQT, HY, QG, GG. Western blot analysis was applied to determine the expression of RAGE, p22Phox, p47Phox, p53 and bax proteins and ELISA analysis was used to detect the levels of TNF-α, IL-1, IL-6, caspase-3, caspase-9. Results The contents of RAGE, p22Phox, p47Phox, bax, caspase-3, caspase-9, phospho-p38MAPK, NF-κB and TNF-α, IL-1 and IL-6 significantly increased in model group cells(P<0.01), and the relative expression of p53 was significantly down-regulated(P<0.01) in model group cells. After treated with 50 μmol·L-1quercetin, isoquercitrin, hyperoside, quercetin-3′-O-glucoside, gossypetin-8-O-glucuronide, the content of proteins and inflammatory factors were close to normal group. Conclusion The five flavonoids inAbelmoschusmanihot(L.) Medicus can inhibit AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB signaling pathway in GLUTag cells.

Malvaceae;Abelmoschusmanihot(L.) Medicus;GLUTag cell; AGEs; RAGE; flavonoids

時(shí)間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.024.html

2017-02-03,

2017-03-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473408，81673533)；江蘇高等學(xué)校中藥學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No ysxk-2014)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目(No NCET-13-0873)

蔡紅蝶(1990-)，女，碩士生，研究方向:中藥功效物質(zhì)基礎(chǔ),E-mail: caihongdie@foxmail.com; 宿樹(shù)蘭(1974-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥資源化學(xué)及方劑功效物質(zhì)基礎(chǔ)，通訊作者，E-mail: sushulan1974@163.com； 段金廒(1956-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，中國(guó)自然資源學(xué)會(huì)中藥及天然藥物資源專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主任委員，國(guó)家“973”計(jì)劃首席科學(xué)家，E-mail: dja@njucm.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.012

A

1001-1978(2017)06-0798-08

R282.71；R284.1；R322.45；R329.25；R392.12摘要:目的 探討黃蜀葵花中5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)腸道L細(xì)胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。方法 200 mg·L-1AGEs作用腸道于L細(xì)胞株GLUTag細(xì)胞，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中RAGE、p22Phox、p47Phox、p53、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1、IL-6、caspase-3、caspase-9的含量。實(shí)驗(yàn)分為7組：空白對(duì)照組(NG)、模型組(AGEs)、槲皮素組(QT)、異槲皮苷組(IQT)、金絲桃苷組(HY)、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷組(QG)、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷組(GG)。NG細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM低糖培養(yǎng)基中；AGEs細(xì)胞培養(yǎng)于含200 mg·L-1AGEs的DMEM低糖培養(yǎng)基中；給藥組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含50 μmol·L-1各黃酮單體及含200 mg·L-1AGEs的DMEM低糖培養(yǎng)基中。各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中RAGE、p22Phox、p47Phox、p53、Bax、p-p38MAPK、NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1、IL-6的含量及caspase-3、caspase-9的活性。結(jié)果 模型組細(xì)胞中RAGE、p22Phox、p47Phox、Bax、caspase-3、caspase-9、Phospho-p38MAPK、NF-κB相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的分泌量明顯上調(diào)(P<0.01)，p53相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)。50 μmol·L-1槲皮素、異槲皮苷、金絲桃苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷分別給藥后，各蛋白的相對(duì)表達(dá)量及炎癥因子的分泌量接近正常組。結(jié)論 黃屬葵花中5種黃酮類(lèi)化合物能明顯抑制腸道L細(xì)胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路。