兩株紅樹林根際土壤放線菌的鑒定和抗菌活性研究

吳 越，李小俊，陳建宏，蔣蓮秀，何玉林，韋晗寧，孫承航，黃大林

(1.桂林醫學院基礎醫學院微生物實驗室，廣西 桂林 541004；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫藥生物技術研究所微生物化學研究室，北京 100050)

兩株紅樹林根際土壤放線菌的鑒定和抗菌活性研究

吳 越1，2，李小俊2，陳建宏1，蔣蓮秀1，何玉林1，韋晗寧1，孫承航2，黃大林1

(1.桂林醫學院基礎醫學院微生物實驗室，廣西 桂林 541004；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫藥生物技術研究所微生物化學研究室，北京 100050)

目的 對分離自廣西北侖河口紅樹林根際土壤的兩株放線菌(B200、B205)進行抗菌活性研究及鑒定。方法 觀察兩株放線菌的形態特征；通過PCR擴增、測定并比對16S rRNA基因序列,采用鄰接法構建系統發育樹并進行分析；通過液體發酵、萃取等方法，分別獲得發酵液水相、發酵液酯相和菌絲丙酮浸提液三類樣品；樣品通過紙片擴散法進行抗菌活性測定。結果 從紅樹林根際土壤分離的兩株放線菌，其發酵液具有較強的廣譜抗菌活性，菌株的16S rRNA基因序列對比結果顯示，菌株B200和B205分別與有效發表菌株AgromycessubbeticusDSM16689T的相似率為98.01% 和MicromonosporarosariaDSM 803T的相似率為99.73%， 菌株B200可能為壤霉菌屬潛在新種，B205初步鑒定是小單孢菌MicromonosporarosariaDSM 803T的變種。結論 分離自廣西北侖河口紅樹林根際土壤的兩株放線菌其次級代謝產物有較強抗菌活性，具有從中發現新抗生素的潛力。

北侖河口；紅樹林；放線菌；抗菌活性；耐藥菌；16S rRNA

隨著耐藥病原菌的不斷增多，以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)及腸桿菌屬(Enterbactersp)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)為代表的ESKAPE耐藥問題給臨床治療帶來了極大困擾，迫切需要我們挖掘新型抗生素[1-3]。

放線菌是天然抗生素的重要來源[4]。臨床上常用的抗生素大部分由放線菌產生，如鏈霉素(streptomycin)、土霉素(oxytetracycline)、卡那霉素(kanamycin)及絲裂霉素(mitomycin)等。應用于臨床試驗的800個微生物來源的天然化合物中，67%來源于放線菌，主要是鏈霉菌(52%)和稀有放線菌(15%)[5-6]。

放線菌分布廣泛，在農田、湖泊等環境都有發現。隨著研究不斷深入，研究者們把目光從普通環境放大到如南極、沙漠、鹽湖、荒漠和海洋等特殊環境，尋找新的微生物資源，以利于發現新型抗生素。特殊環境的微生物為適應高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽、高壓、缺水干旱等惡劣的生存條件，形成了其獨特的生理機能及其特有的代謝方式，并能夠產生許多具有特殊功能的新型生物活性物質，是新抗生素極為豐富的來源[7-8]。

紅樹林是指生長在熱帶及亞熱帶海岸潮間帶的一種特殊植物群落，是熱帶、亞熱帶海岸地帶的一種珍貴濕地類型和生態系統。因為該地帶處于海水、淡水交匯的特殊環境,受潮汐作用影響，使土壤兼具海洋與陸地的特點,加之紅樹林共生生物的供養,該地區土壤蘊藏著極為豐富獨特的放線菌微生物資源[9]。如Xie等[10]從我國各地采集約200 份紅樹林根際土壤和植物組織樣品，從中共分離放線菌2 000多株，并鑒定了放線異壁酸菌屬、阿薩諾氏菌屬、野野村菌屬、小單孢菌屬、小雙孢菌屬、鏈霉菌屬和疣孢菌屬等7個屬中13個新種，并建立了繼生菌新屬。研究表明[11]，生長在紅樹林這樣一種特殊生態環境中的放線菌較其他生境有更好的抗菌、抗腫瘤活性，且結構新穎。從紅樹植物根際土中分離的放線菌對病原菌的拮抗活性，比例要高于分離自菜園土中放線菌的活性。Wang等[12]對8 種不同生境的放線菌聚醚化合物合成基因的篩選也表明，紅樹林環境比其他環境有更多的陽性菌株。美國加州大學Scripps海洋研究所發現的鹽孢菌屬對其中一株菌CNB-392的發酵液進行化合物分離，從中分離鑒定出了一系列的結構新穎的化合物，命名為鹽孢菌素(salinosporamides)，并已進入臨床Ⅰ期研究[13]。因此，紅樹林作為一種特殊的生態環境，其根系放線菌的種類和數量較為豐富，是一類尚未很好開發和利用的微生物資源庫和新化合物庫[14]。

紅樹林環境中的放線菌有巨大的開發潛力，我們發掘少之又少，加之抗生素耐藥情況愈來愈嚴重，發現新型抗生素迫在眉睫。因此，我們對廣西北侖河口國家級紅樹林自然保護區中紅樹林根際土壤樣品研究，發現2株活性較強的菌株，對14種藥敏試驗測試菌均有抑制作用，最后又對其分類地位進行鑒定，為尋找新抗生素奠定了科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 2014年7月采集廣西北侖河口國家級紅樹林自然保護區真紅樹植物白骨壤、木欖根際10 cm以下土壤海泥，共2份樣品，實驗室4 ℃保藏備用。

1.1.2 培養基 ① 分離培養基：改良ISP2培養基：酵母粉4 g,麥芽浸膏5 g,葡萄糖4 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.3～7.5。HL2培養基[15]：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，胰蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.3～7.5。② 斜面培養基：改良ISP2固體培養基。③ 發酵培養基：改良ISP2液體培養基。④ 藥敏試驗菌株培養基：Mueller- Hinton (M-H)培養基(英國 OXOID)。

1.1.3 抑制劑(mg·L-1) 萘啶酮酸25，放線菌酮50，重鉻酸鉀25。

1.1.4 藥敏試驗測試菌株 銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) ATCC 27853、銅綠假單胞菌耐藥株2774、大腸埃希菌(Escherichiacoli) ATCC 25922、大腸埃希菌耐藥株2800、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus) ATCC 25923、金黃色葡萄球菌耐藥株ATCC43300、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) ATCC 29212、糞腸球菌耐藥株ATCC 33186、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia) ATCC 10031、肺炎克雷伯菌耐藥株ATCC 700603、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii) ATCC 19606、鮑曼不動桿菌耐藥株2799、白假絲酵母菌(Candidaalbicans) CCTCC 93025、羅倫隱球菌(Cryptococcuslaurentii) CCTCC 91013，菌株均來自中國醫學科學院醫藥生物技術研究所。

1.1.5 試劑與儀器 Chelex100樹脂，美國BioRad公司；2×Easy Taq SuperMix、放線菌酮，均購于北京全式金公司；重鉻酸鉀購于Sigma公司；萘啶酮酸、DNA Marker、引物(27F,1492R)、GelGreen染料，購自上海生工生物工程股份有限公司；其他試劑為國產分析純。

電泳儀DYY-6C型，北京市六一儀器廠；雙人單面潔凈工作臺，新加坡ESCO；小型離心機Centrifuge 1-14購于德國Sigma公司；凝膠成像儀Gel DocTMXR+購自美國Bio-Rad公司；WZT-1M細菌比濁儀，上海勁佳；全恒溫培養箱ZDP-2120、旋轉式搖床ZHWY-211C,上海智城分析儀器制造公司；臺式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS，上海申安醫療器械廠；PCR擴增儀Veriti 96 well fast thermal cycler，美國Applied Biosystems公司；旋轉蒸發儀OSB-2100，日本EYELA公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 參照戴素娟等[16]土樣處理辦法，新鮮土樣置無菌平皿中室溫條件下自然風干，用無菌研缽研磨成粉面狀。稱取5 g土壤樣品，45 mL無菌水溶解， 28 ℃、180 r·min-1搖床振蕩45 min；吸取1 mL土壤懸液至9 mL無菌水中，連續進行10倍梯度稀釋，使其終濃度為10 g·L-1和1 g·L-1，各取200 μL，分別涂布于2種分離培養基平板上，置恒溫培養箱28 ℃培養。

1.2.2 菌落的分離與保存 培養2～4周后，根據菌落特征初步排重，挑取單菌落于改良ISP2固體培養基上進行分區劃線菌落純化，直至得到純培養物。將長勢良好的純化菌株轉接至改良ISP2斜面培養基，置4 ℃保存；同時用20%甘油作為保護劑，-20 ℃保藏。

1.2.3 16S rRNA基因序列的測定和系統發育分析 ① 采用Chelex -100法[17]提取基因組DNA。② 擴增引物為細菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。50 μL PCR反應體系：2×Easy Taq SuperMix 25 μL；27F (20 μmol·L-1) 1.5 μL；1492R (20 μmol·L-1) 1.5 μL；模板2.5 μL； 無菌水19.5 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；將所有陽性結果的PCR產物交由英淮捷基(上海)貿易有限公司測序。③ 所得序列利用BLAST程序和EzTaxon-e工具[18]進行相似性比對。從中選取相似性較高的有效發表菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象，然后用BioEdit進行多序列比對，系統進化矩陣根據Kimura-2模型估算，用MEGA 5.0軟件[19]采用鄰接法(Neighbor-Joining)進行聚類分析，并構建系統進化樹[20]，重復取樣1 000 次進行自展值(Bootstrap value)分析來評估系統進化樹拓撲結構的穩定性。

1.2.4 抗菌活性篩選 ① 將長勢良好的菌株接種于裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，180 r·min-1、28 ℃培養7 d，發酵液4 500 r·min-1離心30 min，上清液用等體積的乙酸乙酯萃取，酯相濃縮干燥后，用3 mL甲醇溶解于樣品瓶中備用。水相留取60 mL揮發干燥后用3 mL甲醇水溶液溶解備用。用同樣的方法對一定量的丙酮浸泡過夜菌體浸泡液進行制備。② 將斜面生長良好的藥敏試驗測試菌株接種于裝有20 mL液體培養基的100 mL三角瓶中，180 r·min-1、37 ℃培養12 h，將0.5麥氏濃度單位菌懸液按1%比例加入冷卻至55 ℃左右的無菌M-H瓊脂培養基中，搖勻、傾注至培養皿內，每皿15～20 mL，置4 ℃備用。③ 采用紙片擴散法進行抗菌活性檢測。分別吸取已制備得酯相、水層、菌體粗提物三類樣品各60 μL至直徑為6 mm、厚度為2 mm的圓形無菌濾紙片上，待其揮發干燥后，貼于含有藥敏試驗測試菌的平板上，平板于37 ℃培養24 h，觀察并記錄抑菌圈的大小。

2 結果

2.1 抗菌活性 紙片擴散法試驗采用標準菌株進行抗菌試驗，藥敏試驗結果顯示菌株B200和B205對14株革蘭陽性菌、革蘭陰性菌包括敏感株和耐藥株及真菌標準菌株均具有較好的活性(Tab 1)，對敏感株抑菌活性高于耐藥株，但B200對大腸埃希菌耐藥株(耐β-內酰胺酶類復合藥物)抑菌活性明顯高于敏感株，B205對真菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及鮑曼不動桿菌表現出超強抑菌活性(Fig 1)。

Fig 1 Result of antibacterial activities of some actinomycetes

Left: Antibacterial activities ofAcinetobacterbaumannii; Right: Antibacterial activities ofPseudomonasaeruginosa. 24 represented strain B200, 27 represented strain B200.

2.2 菌落特征 在改良的ISP2培養基上，菌株B200和B205生長良好，菌株B200表面光滑濕潤，半透明，無褶皺，邊緣整齊，細菌形態，產淡黃色色素。菌株B205表面干燥，有褶皺，生長緩慢，菌落質地致密緊實；所以菌落緊貼培養基生長，不易挑起，挑起后不易破碎；當孢子絲產生大量孢子并布滿菌落表面后才形成顆粒狀,典型放線菌形態；產酒紅色色素可使培養基變色(Fig 2)。

Tab 1 The antibiotic activity of B200 and B205

P.a:Pseudomonasaeruginosa; E.c:Escherichiacoli; S.a:Staphyloccocusaureus; E.f:Enterococcusfaecalis; K.p:Klebsiellapneumonia; A.a:Acinetobacterbaumannii; C.a:Candidaalbicans; C.l:Cryptococcuslaurentii. S: Sensitive strain; R: Resistant strain

Fig 2 Colony morphology of two actinomycetes

2.3 16S rRNA基因擴增 采用Chelex-100法提取基因組DNA,PCR成功擴增出放線菌樣本的16S rRNA，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產物電泳條帶清晰，特異性強，大小在1 500 bp 左右(Fig 3)。

Fig 3 PCR products of 16S rRNA gene

2.4 基于基因序列構建的兩株紅樹林根際土壤放線菌的系統發育樹分析 測得兩株菌的16 S rRNA基因全長序列，登錄EzTaxon，比對結果發現B200與AgromycessubbeticusDSM 16689T的相似率為98.01%，與該屬的其他種相似率都在98%以下，而且在N-J系統進化樹中，菌株B200與壤霉菌屬部分有效發表菌株聚成一簇，且形成獨立的進化分支 (Fig 4)，提示該菌株可能為壤霉菌屬潛在新種，該菌株的多相分類還在研究中。B205采用鄰接法構建其與相關菌株的系統發育樹，發現其與MicromonosporarosariaDSM 803T最相似，相似率為99.73%，且在N-J樹上與之為一簇，B205初步鑒定是小單孢菌MicromonosporarosariaDSM 803T的變種(Fig 5)。

3 討論

放線菌(actinomycetes)是一類具有重要藥用價值和多種用途的微生物，廣泛分布于自然界[21]。生長在紅樹林這種極端環境的放線菌，由于多樣、特殊的生態系統，形成其獨特的代謝方式和途徑，其次級代謝產物在結構、類型以及生物活性等方面都呈現出與普通生境放線菌不同的特點。許琳雅等[22]從StreptomycesNo.H74-18菌株的次級代謝產物中分離到抗霉素類(A1a和A1b等)化合物，并發現新化合物antimycinA18及A19。張慧敏等[23]從放線菌發酵液中高通量篩選端粒酶抑制劑，發現 14 株放線菌有較好的抑制作用。王淑霞等[24]從威海、福建沿海海泥土壤樣品及廣東紅樹林根部土壤樣品中共分離到17株具抗腫瘤活性的放線菌，并從菌株WH1-216-6的次級代謝產物中分離出6個吡啶類生物堿，都具有較高抑制癌細胞活性， 其中caerulomycineH、caerulomycineF、caerulomycineG鑒定為新化合物。因此，來源于紅樹林的放線菌有巨大的研究價值和開發潛力。

廣西擁有豐富的紅樹林資源，是我國目前紅樹林分布最廣的地區，達6 170公頃，占有全國紅樹林面積的37%。有紅樹林植物12種，分布于英羅港、丹兜海、鐵山港、欽州灣、江平、北侖河口等地[25]。本實驗采集廣西北侖河口國家級紅樹林自然保護區紅樹植物根際土壤，分離得到的菌株B200、B205對14種藥敏試驗測試菌都表現出較好的活性，特別是菌株B200對革蘭陽性、陰性致病菌及真菌均有較好的抗菌活性，且可能為壤霉菌屬潛在新種。以往文獻報道，產生生物活性代謝物質的紅樹林放線菌多為鏈霉菌屬、小單孢菌屬、諾卡氏菌屬、擬諾卡氏菌屬及馬杜拉菌屬等[26]，該屬的次級代謝產物相關文獻較少，值得進一步探究，菌株B200的其他相關研究仍在進行。該研究結果表明廣西紅樹林根際土壤藥用放線菌資源豐富，為新藥的研究與開發奠定了堅實基礎。

Fig 4 Neighbour-Joining tree showing phylogenetic relationships between strain B200 and representatives of family Agromyces based on 16S rRNA gene sequences

Fig 5 Neighbour-Joining tree showing phylogenetic relationships between strain B205 and representatives of family Micromonospora based on 16S rRNA gene sequences

(致謝：本實驗在中國醫學科學院醫藥生物技術研究所完成，感謝孫承航研究員及實驗室老師對本實驗的指導和幫助。)

[1] 邱麗莉. ESKAPE 6 種抗生素的耐藥狀況[J]. 中國誤診學雜志, 2011, 11(36): 8960-1.

[1] Qiu L L. Drug resistance of ESKAPE 6 antibiotics[J].ChinJMisdiagn, 2011, 11(36): 8960-1.

[2] Shirley D A, Heil E L, Johnson J K. Ceftarolinefosamil: a brief clinical review[J].InfecDisTher, 2013,2(2): 95-110.

[3] Qin S, Xing K, Jiang J H, et al. Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2011, 89(3): 457-73.

[4] Berdy J. Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where we are heading[J].JAntibiot, 2012, 65(8): 385-95.

[5] 王長云, 邵長倫, 傅秀梅, 等. 中國海洋藥物資源及其藥用研究調查[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版),2009, 39(4): 669-75.

[5] Wang C Y, Shao C L, Fu X M, et al. Investigation on marine drug resources and its medicinal use in China [J].PeriodOceanUnivChina, 2009, 39(4):669-75.

[6] Yang R Y, Li C Y, Lin Y C, et al. Lactones from a brown alga endo-phytic fungus (No.ZZF36) from the South China Sea and their antimicrobial activities[J].BioorgMedChemLett, 2006, 16(16): 4205-8.

[7] 李 蓉, 張京良, 江曉路, 管華詩. 紅樹林放線菌的篩選與抗真菌和抗腫瘤活性的測定[J].食品與生物技術學報，2010, 29(1): 94-7.

[7] Li R, Zhang J L, Jiang X L, Guan H S. Screening of mangrove actinomycetes and determination of antifungal and antitumor activity [J].JFoodSciBiotechnol, 2010, 29(1): 94-7.

[8] 蔡超靖, 丁彥博, 單越琦, 穆云龍. 海洋放線菌-藥物開發的新興資源[J].國外醫藥抗生素分冊, 2012, 33(1): 22-9.

[8] Cai C J, Ding Y B, Shan Y Q, Mu Y L. Emerging resources of marine actinomycetes drug development [J].WorldNotesAntibiot, 2012, 33(1): 22-9.

[9] 林 鵬, 張瑜斌, 鄧愛英, 莊鐵誠. 九龍江口紅樹林土壤微生物類群及抗菌活性[J]. 海洋學報, 2005,27(3):133-41.

[9] Lin P, Zhang Y B, Deng A Y, Zhuang T C. Microflora and antimicrobial activities of soil microorganisms in mangrove forests in the Jiu-long Estuary, China[J].ActaOceanolSin,2005,27(3):133-41.

[10]Xie Q Y, Wang C, Wang R, et al. Jishengella endophytica gen. nov., sp. Nov., a new member of the family Micromonosporaceae[J].IntJSystEvolMicrobiol, 2011, 61(5): 1153-9.

[11]鄭志成, 周美英, 姚炳新. 紅樹林根際放線菌的組成及生物活性[J]. 廈門大學學報(自然科學版), 1989, 28(3):306-10.

[11]Zheng Z C, Zhou M Y, Yao B X. Composition and biological activity of actinomycetes in mangrove rhizosphere[J].JXiamenUniv(NatSci), 1989, 28 (3):306-10.

[12]Wang H, Liu N, Xi L, et al. Genetic screening strategy for rapid access to polyether ionophore producers and products in actinomycetes[J].AppEnvironMicrobiol, 2011, 77(10): 3433-42.

[13]Mayer A M, Glaser K B, Cuevas C, et al. The Odyssey of marine pharmaceuticals: a currentpipeline perspective[J]．TrendsPharmacolSci，2010，31(6):255-65.

[14]孫藝華, 馮 鴿, 王 超. 紅樹林放線菌多樣性及新型糖苷類化合物合成潛力發掘[J].中國海洋藥物, 2013, 32(1):46-54.

[14]Sun Y H, Feng G, Wang C. Diversity and new glycosides synthesis of potential of actinomycetes in mangroves [J].ChinJMarDrugs, 2013, 32(1):46-54.

[15]洪 亮. 紅樹林環境稀有放線菌的分離、初步鑒定和活性評價[D].儋州：華南熱帶農業大學，2007.

[15]Hong L. Bioprospecting for mangrove rare actinomycetes [D].Danzhou:South China University of Tropical Agriculture, 2007.

[16]戴素娟, 李 靜, 劉少偉, 等. 河南神仙洞放線菌資源勘探及抗菌活性篩選[J].中國抗生素雜志, 2015, 40(9): 641-8.

[16]Dai S J, Li J, Liu S W, et al. Study on diversity and bioactivity of actinomycetes isolated from the Shenxiandong in Henan province[J].ChinJAntibiot, 2015, 40(9): 641-8.

[17]周雙清, 黃小龍, 黃東益, 等. Chelex-100快速提取放線菌RNA作為PCR擴增模板[J]. 生物技術通報, 2010, 24 (2): 123-5.

[17]Zhou S Q, Huang X L, Huang D Y, et al. A rapid method for extracting RNA from actinomycetes by Chelex-100[J].BiotechnolBull, 2010, 24(2): 123-5.

[18]Kim O S, Cho Y J, Lee K, et al. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species[J].IntJSystEvolMicrobiol, 2012, 62(3): 716-21.

[19]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J].MolBiolEvol, 2011, 28(10): 2731-9.

[20]Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].MolBiolEvol, 1987, 4(4): 406-25.

[21]李小俊, 吳 越, 張偉銘, 等. 河北九蓮城淖爾可培養放線菌多樣性及抗菌活性篩選[J]. 微生物學通報, 2016, 43(7): 1473-84.

[21]Li X J, Wu Y, Zhang W M, et al. Biodiversity and antimicrobial activity of culturable actinobateria isolated from Jiuliancheng Nur in Hebei province[J].MicrobiolChina, 2016, 43(7): 1473-84.

[22]許琳雅. 來源于南海紅樹林底泥抗菌放線菌的活性化學成分研究[D]. 廣州：暨南大學，2010.

[22]Xu L Y. Research the active chemical constituents of antimicrobial actinomycetes from mangrove sediments of the South China Sea[D]. Guangzhou: Jinan University,2010.

[23]張慧敏, 曹 瑩, 王衛國,等. 從放線菌發酵液中高通量篩選端粒酶抑制劑[J].中國藥理學通報, 2010,26(1):40-3.

[23]Zhang H M, Cao Y, Wang W G，et al. High - throughput screening of telomerase inhibitor from actinomycete fermentation broth [J].ChinPharmacolBull,2010,26(1):40-3.

[24]王淑霞. 細胞毒活性海洋放線菌的篩選及兩株目標菌株次級代謝產物的研究[D]. 青島：中國海洋大學, 2007.

[24]Wang S X. Screening of cytotoxic marine actinomycetes and studies on secondary mtabolites of two strains[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2007.

[25]石 莉. 中國紅樹林的分布狀況、生長環境及其環境適應性[J]. 海洋信息, 2002,(4):14-8.

[25]Shi L. Distribution, growth environment and environmental adaptability of mangrove species in China[J].OceanInf, 2002,(4):14-8.

[26]蔣蓮秀, 莫 剛, 戴支凱,等. 紅樹林放線菌生物多樣性及其代謝產物的研究進展[J]. 貴州農業科學, 2014, 42(10):158-63.

[26]Jiang L X, Mo G, Dai Z K, et al. Research progress in biodiversity and metaboliites of actinomycetes isolated from mangrove soils[J].GuizhouAgricSci, 2014,42(10):158-63.

Identification and antimicrobial activity research on two actinomycetes isolated from mangrove rhizosphere soils

WU Yue1，2，LI Xiao-jun2,CHEN Jian-hong1,JIANG Lian-xiu1,HE Yu-lin1, WEI Han-ning1, SUN Cheng-hang2,HUANG Da-lin1

(1.MicrobiologyLaboratoryofFacultyofBasicMedicalSciences,GuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541004,China;2.MicrobiochemistryLaboratory,InstituteofMedicinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Aim To identify and study antimicrobial acticity of actinomycetes isolated from mangrove rhizosphere soils in Beilun Estuary, Guangxi,China. Methods The typical morphological characteristics of two actinomycetes were observed. To determine the phylogenetic position of the isolates, 16S rRNA gene sequences were obtained by PCR amplification and direct sequencing, and then compared with the gene database, the phylogenetic tree was constructed using the neighboring method. Crude extracts were obtained from fermentation broth extracted by ethyl acetate and mycelia extracted by acetone, respectively. The antibacterial and antifungal activities of the crude extracts were evaluated using the disk diffusion method. Results Significant broad-spectrum antibacterial activities of two actinomycetes were isolated from mangrove rhizosphere soils in Beilun Estuary. The highest similarity of 16S rRNA gene sequence between strain B200 and the validly described speciesAgromycessubbeticusDSM16689T, between strain B205 and the validly described speciesMicromonosporarosariaDSM803Twas 98.01% and 99.73%, respectively, which indicated that the strain B200 was Agromyces potential new taxa, and B205 was identified asMicromonosporarosariaDSM 803Tvariants. Conclusions Two actinomycetes isolated from mangrove rhizosphere soils in Beilun Estuary,Guangxi,and its fermentation products show significant antibacterial activity. Mangrove rhizosphere soils are rich in culturable medicinal actinobacteria, which could be a potential source for the discovery of new antibiotics, and deserves further research.

Beilun Estuary; mangrove; actinomycetes; antibiotic activity; drug resistant bacteria; 16S rRNA

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.028.html

2017-02-24,

2017-03-24

國家自然科學基金資助項目(No 81460537)；廣西省自然科學基金資助項目(No 2014GXNSFAA118196)

吳 越(1987-)，女，碩士生，研究方向：放線菌資源、抗菌及抗腫瘤物質， E-mail:505695804@qq.com； 黃大林(1964-)，男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向：放線菌資源及相關代謝產物，通訊作者,E-mail:1217803175@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.014

A

1001-1978(2017)06-0813-06

R342.2；R378.994；R978.1