骨碎補含藥血清經wnt/β-catenin信號通路對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

陳云剛, 譚國慶,任維龍,徐展望

(山東中醫藥大學 1.第一臨床醫學院， 2.附屬醫院脊柱骨科，山東 濟南 250014)

骨碎補含藥血清經wnt/β-catenin信號通路對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

陳云剛1, 譚國慶2,任維龍1,徐展望1

(山東中醫藥大學 1.第一臨床醫學院， 2.附屬醫院脊柱骨科，山東 濟南 250014)

目的 研究骨碎補含藥血清經wnt/β-catenin信號通路對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的作用，探討其可能的作用機制。方法 用不同濃度含藥血清干預BMSCs，CCK-8法分別檢測血清干預BMSCs 3、5、7、9 d BMSCs的增殖能力，連續誘導7、10、14 d并進行ALP活性檢測，誘導21 d后茜素紅染色評價BMSCs的礦化能力，RT-PCR法檢測β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX-2及Osteriex mRNA表達；ELISA法檢測細胞內β-catenin、LRP5蛋白表達量。結果 骨碎補含藥血清具有明顯的促進BMSCs增殖的作用，在一定的時間段提高了ALP活性，促進鈣化結節形成；上調wnt/β-catenin信號通路β-catenin、LRP5、RUNX-2及Osteriex mRNA表達；下調GSK-3β mRNA表達，上調β-catenin、LRP5蛋白表達。結論 骨碎補含藥血清可以促進BMSCs的增殖及成骨分化，其機制與激活wnt/β-catenin信號通路，上調β-catenin、LRP5、RUNX-2及Osteriex mRNA表達，下調GSK-3β mRNA表達及上調β-catenin、LRP5蛋白表達密切相關。

骨碎補；含藥血清；骨髓間充質干細胞；wnt/β-catenin；增殖；堿性磷酸酶；成骨分化

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是絕經后婦女和老年人的常見病，以骨量丟失為主要特征，易發生脆性骨折，具有較高的致殘率和致死率，給社會增加了沉重的負擔，是僅次于心血管疾病的第二大疾病。據國際骨質疏松基金會統計，34%的絕經期婦女、20%的老年男性會發生骨質疏松癥[1]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化能力，可以定向分化為成骨細胞。隨著研究的深入，BMSCs在OP發病過程中發揮的作用日益引起關注，其成骨分化能力的強弱可能是OP的發病機制之一。研究證實，經典的wnt/β-catenin信號通路在調控BMSCs向成骨細胞分化的過程中起到關鍵性作用。研究發現[2-3]，補腎類中藥對OP具有良好的治療效果，并促進BMSCs向成骨細胞分化。骨碎補(Rhizoma drynariae)作為補腎壯骨代表藥物，其活性成分骨碎補黃酮已被證實可以促進體外BMSCs增殖，并促進其向成骨方向分化[4]。目前，關于骨碎補治療OP的實驗研究多集中在其促進BMSCs增殖、促進成骨分化及成骨相關基因的表達上，探討骨碎補經wnt/β-catenin信號通路促進成骨分化的研究極少。本實驗以BMSCs為靶細胞，通過體外培養的方式探討骨碎補含藥血清促進BMSCs成骨分化可能作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠40只，♀♂各半，3月齡，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物質量合格證號：SCXK(魯)20140007，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 試劑及試劑 骨碎補購于山東中醫藥大學附屬醫院藥房，L-DMEM培養基(批號F04ED090,MACGENE)、南美胎牛血清(批號NZJ1221，HyClone)、β-甘油磷酸鈉(批號S20S7G21494，上海源葉生物科技有限公司)、堿性磷酸酶染液(批號20160818，南京建成生物有限公司)、堿性磷酸酶檢測試劑盒(批號20160813，南京建成生物有限公司)，TRIpure Reagent(批號231527AX, 北京艾德萊生物科技有限公司)，Transcriptor Frist Strand cDNA Synthesis Kit(批號13713422,Roche)，Rat β-catenin ELISA Kit(批號GR201612-1,武漢基因美生物科技有限公司)，Rat LRP5 ELISA Kit(批號GR201612-1,武漢基因美生物科技有限公司)，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，β-actin引物序列：上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′；β-catenin序列：上游5′-TGGTGGGCTGCAGAAAATGGTT-3′，下游5′-ACGATGGCCGGCTTGTTGC-3′； LRP5序列：上游5′-CCTGGCGCTGTGACGGCTTCC-3′， 下游5′-CAATGGCGCTGCTGTGGGCTGGTA-3′； GSK-3β序列：上游5′-TGGGTCATTTGGTGTGGTAT-3′，下游5′-GACCTCATCTTTCTTCTCGC-3′。RUNX-2序列：上游5′-GAACCCACGGCCCTCCCTGAACTC-3′，下游5′-AGCGGCGTGGTGGAATGGATGGAT-3′，Osterix序列：上游5′-CTGGGGGCAATTGGTTAGGTGGTG-3′，下游5′-GGGGGCAAAGTCAGACGGGTAAGT-3′。

1.3 器材 CO2培養箱(HF160W，上海力康發展有限公司)，臺式高速冷凍離心機(Neofuge23R，上海力康發展有限公司)，研究用萬能級顯微鏡(OLYMPUS/IX71，日本奧林巴斯公司)，實時熒光定量PCR儀(LightCycler480II,瑞士)，酶聯免疫儀(美國Biotek Elx800，美國伯騰儀器有限公司)，流式細胞儀(BD FACSVERSE,美國)，數顯恒溫水浴鍋HH-2(江蘇金壇榮華儀器公司)，微量紫外可見光分光光度計(凱奧/K5600，北京凱奧科技發展有限公司)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD,上海博訊實業有限公司)。

2 方法

2.1 骨碎補含藥血清制備 根據成人每日所需藥量換算成大鼠總的用藥劑量，將骨碎補用水煎法進行藥液濃縮，所得藥液4℃冰箱儲藏備用，用藥前恢復到常溫。SPF健康SD大鼠32只，3月齡，體質量(200±30)g，隨機均分為低劑量、中劑量、高劑量、空白組4組，每組8只，每日8 ∶00am和2 ∶00pm灌胃，低劑量組每日灌服正常人給藥量1倍劑量(0.81 g·kg-1)骨碎補水煎液，中劑量組每日灌服正常人給藥量5倍劑量(4.05 g·kg-1)骨碎補水煎液,高劑量組每日灌服正常人給藥量10倍劑量(8.1 g·kg-1)骨碎補水煎液,空白組每日灌服等體積生理鹽水，連續3 d。末次灌胃全天劑量，1.5 h后腹主動脈取血，靜置2 h后，離心(2 500 r·min-1,4 ℃，15 min)后去上層血清，56℃水浴滅活補體，0.22 μm微孔濾膜過濾，-20℃保存。

2.2 分組和給藥 將細胞分為空白1組、空白2組、空白3組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。空白1組(Control group 1)給予L-DMEM、100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素、10%胎牛血清培養基；空白2組(Control group 2)給予L-DMEM、100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素、10%空白大鼠血清培養基；空白3組(Control group 3)給予L-DMEM、10%空白大鼠血清及成骨分化誘導液(100 U·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素的DMEM培養基、1 mmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸)；低劑量組(low dose group，LDG)給予L-DMEM，10%低劑量含藥血清、成骨分化誘導液；中劑量組(middle dose group，MDG)給予L-DMEM、10%中劑量含藥血清、成骨分化誘導液；高劑量組(high dose group，HDG)給予L-DMEM、10%高劑量含藥血清、成骨分化誘導液。

2.3 骨髓間充質干細胞的分離和擴增 采取全脊髓貼壁法，按以下方法分離培養SD大鼠BMSCs:大鼠麻醉后，置于75%酒精溶液浸泡15 min，超凈臺內快速去除周圍組織，取出股骨，75%酒精溶液浸泡30 s,咬骨鉗咬除兩干骺端，5 ml注射器吸取含10%胎牛血清和100 kU·L-1青、鏈霉素的L-DMEM培養基反復沖洗髓腔，直至骨質外觀微亮。收集髓腔沖洗液，轉移至25 cm2培養瓶中，37℃，5% CO2培養箱中繼續培養，24 h后首次換液，以后每2 d換液1次。待細胞融合80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1 ∶3傳代，繼續培養。選擇生長良好的第3代細胞，用流式細胞儀進行細胞表面抗原檢測，以確定其具有BMSCs的免疫表型。

2.4 骨髓間充質干細胞的鑒定 根據查閱文獻[5]，BMSCs的表面抗原標記對CD29、CD44、CD105等反應陽性，CD34、CD45等反應陰性。檢測步驟如下:首先用 0.25%胰蛋白酶消化細胞，制備單細胞懸液，1 500 rpm離心3 min，PBS重懸,細胞濃度2×108·L-1,PBS沖洗2次取細胞懸液400 μL,分別加入FITC、APC、PE標記的抗體避光孵育40 min，PBS沖洗1次，流式細胞儀檢測。

2.5 CCK-8檢測 選用各組生長狀態良好的第3代細胞，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，以1×107·L-1接種于96孔培養板上，每孔加入100 μL細胞懸液(含細胞數目約1 000個)，每組設6個復孔，分別加入各組對應培養基，標記后置37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，分別在d 3、5、7、9取板檢測。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續孵育4 h終止培養，選擇490 nm波長，在酶標儀上測各孔吸光度(A)，結果以A490吸光度值表示細胞增殖水平。

2.6 ALP活性檢測及礦化結節數計算 另取各組第3代BMSCs，以1×107·L-1接種于24孔板，共72孔。每組18孔，加入相應的培養液連續培養7、10、14 d，每組每次取6孔，按照AKP檢測試劑盒說明書進行ALP活性檢測,562 nm處測定吸光度并換算為金氏單位。將第3代BMSCs接種到6孔板，每組設3個復孔。各組細胞培養至d 21時，棄去培養液，PBS清洗后，95%乙醇固定30 min, 0.2%茜素紅染色30 min，清水沖洗。置40倍鏡下觀察并拍照，隨機選取不重復的12個視野，計數各組細胞的礦化結節數，評價BMSCs的礦化能力。

2.7 wnt/β-catenin信號通路相關mRNA及成骨相關mRNA檢測 BMSCs按1×107·L-1接種到6孔板內培養，待細胞80%以上鋪滿瓶底時，各組分別加入各組對應培養液繼續培養，每2 d換液1次，培養7 d后，用Trizol提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度A260/A280在1.8～2.2。cDNA單鏈合成條件：① 30 ℃，10 min；② 42 ℃，60 min；③ 95 ℃，5 min；④ 5 ℃，5 min，共一個循環。qPCR反應條件:① 95 ℃，5 min；② 95 ℃，20 s；③ 62 ℃，15 s；④ 72 ℃，15 s；⑤ 72 ℃，5 min。②～④為45個循環。檢測各實驗組細胞中基因的表達情況，反應結束后，由電腦自動生成熒光擴增曲線、標準曲線以及熔解曲線，根據靶基因的標準曲線計算各組基因拷貝數，記錄CT值，通過ΔΔCT=(CT目的基因-CT內參基因)處理組-(CT目的基因-CT內參基因)空白組，計算各組2-ΔΔCT值，即得該目的基因給藥組mRNA表達與空白組mRNA的倍數。

2.8 BMSCs總蛋白提取及酶聯免疫法(ELISA)檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、LRP5的表達 取各組連續培養7 d BMSCs細胞，每組取6孔提取細胞總蛋白，按如下方法：胰蛋白酶消化細胞后，4 ℃，1 500 r·min-1離心5 min，PBS洗3次，估計細胞總體積，加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min。離心10 min(12 000 r·min-1,4 ℃)，取上清，-80 ℃保存。取各組細胞總蛋白產物分別按照β-catenin、LRP5酶聯免疫試劑盒操作說明書進行檢測各組蛋白表達水平。

3 結果

3.1 BMSCs形態及流式細胞術表型鑒定結果 剛接種時BMSCs與其他細胞混雜，呈圓形。培養24 h后開始貼壁生長，呈短紡錘狀，數量較少。3 d后貼壁細胞體積逐漸增大，數量增多，細胞逐漸伸展，呈梭形、多角形，開始成簇生長。7～9 d集落數量逐漸增多，并相互融合。9～11 d一般能達到80%以上細胞融合狀態。傳代后細胞呈圓形，接種12 h內貼壁，逐漸伸展呈紡錘形，形態均一，增殖速度較快，5 d可鋪滿瓶底80%以上，呈漩渦狀(Fig 1)。流式細胞儀檢測第3代細胞表面標志物結果顯示，其表面 CD29、CD44、CD45 陽性細胞比率分別為94.17%、95.50%、0.37%，結合BMSCs的形態觀察可以認定本實驗培養細胞為骨髓間充質干細胞。

Fig 1 Photomicrograph of BMSCs cultured for different time points

3.2 CCK-8檢測結果 與空白3組對比，其他各組在各時間點吸光度值更高，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，中、高劑量組在各時間點吸光度值較低劑量組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在7、9 d時，中劑量組和高劑量組對比，無明顯差異，P>0.05。低、中、高劑量組在3～5 d時促進BMSCs增殖作用更明顯，7～9 d進入平臺期。見Fig 2。

Fig 2 Effect of drug-containing serum on proliferation of BMSC

*P<0.05vscontrol group 3;#P<0.05vsControl group 1,2,3,LDG

3.3 ALP染色和活性檢測結果 各組在不同培養液培養后發現，空白3組、低劑量組、高劑量組在7～14 d隨時間延長ALP活性逐漸增強，并維持在一個較高的水平；中劑量組在培養10 d后ALP活性即達到較高的水平，并隨時間延長ALP活性呈現降低趨勢。與空白1組、空白2組、空白3組對比，低、中、高劑量組在各時間點ALP活性更高，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，中劑量組在各時間點ALP活性明顯較其他組更高，以培養10 d ALP活性增強最為明顯(P<0.05)。見Tab 1。

GroupTime7d10d14dControlgroup13.23±0.194.06±0.175.09±0.09Controlgroup23.21±0.104.14±0.145.16±0.18Controlgroup34.37±0.25*5.29±0.16*6.31±0.181*LDG5.22±0.22*#6.14±0.21*#6.71±0.17*#MDG6.17±0.26*#△▽8.91±0.17*#△▽7.88±0.19*#△▽HDG5.38±0.24*#△6.28±0.27*#△6.96±0.18*#△

*P<0.05vsControl group 1,2;#P<0.05vsControl group 3;△P<0.05vsLDG;▽P<0.05vsHDG

3.4 各組BMSCs礦化結節數比較 干預21 d后，各組均有礦化結節形成。茜素紅染色后發現各組均呈現大小不均的紅色致密結節(Fig 3)，與空白1組、空白2組、空白3組比較，低、中、高劑量組礦化結節數均明顯增加(P<0.05)，中濃度組礦化結節數最多，與低、高劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見Tab 2。

Fig 3 A:Control group 1;B:Control group 2;C:Control group 3;D:LDG,E:MDG;F:HDG

Tab 2 Comparisons of mineralized nodule in different groups(n=12)

*P<0.05vscontrol group 1,2;#P<0.05vscontrol group3;△P<0.05vsLDG;▽P<0.05vsHDG

3.5 BMSCs培養7 d β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX2及Osterix mRNA表達水平比較 如Fig 4所示，含藥血清干預7 d后低、中、高劑量組的β-catenin、RUNX2、LRP5及Osterix mRNA表達較空白1組、空白2組明顯增加，GSK-3β明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；中劑量組β-catenin、RUNX2及Osterix mRNA的表達水平明顯高于空白3組低劑量組和高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。

Fig 4 Effect of expression of LRP5, beta-catenin, GSK-3 beta, RUNX2 and Osterix mRNA containing serum on ±s，n=3)

*P<0.05vscontrol group 1,2;#P<0.05vscontrol group 3, LDG,HDG

3.6 BMSCs培養7 d各組Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達水平比較 如Fig 5所示，含藥血清干預7d后低、中、高劑量組，空白3組與空白1組，空白2組相比β-catenin、LRP5蛋白表達組明顯增加(P<0.05)；中劑量組較低、高劑量組，空白3組更能促進β-catenin、LRP5蛋白表達(P<0.05)。

4 討論

中醫學認為骨的生長、發育、成熟、衰退與腎精的盛衰密切相關。黃帝內經曰：“腎者，主骨生髓”。歷代醫家將骨質疏松癥歸納為“骨痿、腎虛、虛勞”等范疇，基本病機為腎精虛衰，不能榮髓，髓不生骨，故多從補腎壯骨論治，以補腎作為治療之本。骨碎補作為補腎壯骨類中藥在臨床應用中已取得不錯的療效[6]，骨碎補提取物在體外實驗中已被證實對BMSCs增殖具有明顯的促進作用，并可以促進BMSCs的成骨分化[4]。因此，應用骨碎補研究其對BMSCs的成骨分化具有明確的理論和實踐基礎。

BMSCs具有多向分化能力，在一定的誘導條件下可以定向分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等[7]，組織工程學中常選用β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸作為成骨誘導劑誘導BMSCs體外定向成骨分化[8]。實驗發現一定濃度骨碎補提取物柚皮苷可以促進BMSCs的增殖，但提取物最佳干預濃度不一[9-11]，分析可能與實驗所用細胞、種類及藥材的差異導致。目前關于骨碎補對BMSCs的體外增殖的作用大都應用其提取物單體直接作用于細胞，含藥血清對BMSCs的體外增殖的研究較少。劉偉等[12]發現高濃度的骨碎補提取物作用細胞會對細胞產生毒性作用或者抑制作用。本實驗發現中劑量骨碎補含藥血清可以在3、5、7、9 d明顯促進BMSCs的增殖，與低劑量組和各空白組比較有明顯差異，而在7 d、9 d中劑量組與高劑量組比較無明顯差異，分析可能是細胞達到一定密度后，由于受培養器材空間的限制，對其繼續增殖產生了影響。本實驗中未發現骨碎補含藥血清對細胞產生毒性作用或抑制作用，在7 d以后即進入平臺期。ALP是一種主要分布在細胞膜上的鈣結合轉運蛋白，是在BMSCs的成骨誘導過程中最早表達的、成骨細胞形成的標志[13]。有文獻指出BMSCs在成骨分化過程中7～14 d是ALP分泌高峰期，本實驗發現中劑量組ALP活性在誘導10 d后達到高峰，與其他各組有明顯差異，且誘導21 d后鈣結節形成的數量最多。

Fig 5 Effect of expression of LRP5 and beta-catenin protein containing serum on ±s，n=3)

*P<0.05vscontrol group1,2;#P<0.05vscontrol group 3, LDG,HDG

目前，骨碎補對治療骨質疏松癥的基礎研究主要集中在其促進BMSCs的增殖及成骨分化，其分子生物學機制研究鮮有報道。眾所周知，經典的Wnt/β-catenin信號通路是調控BMSCs成骨分化的一條重要通路，β-catenin是該通路的關鍵因子，在細胞增殖、定向分化過程中發揮重要作用，其在胞質中的濃度決定著經典Wnt信號通路的激活與關閉。該通路的調控機制為：Wnt蛋白與Frizzled受體及LRP5/6結合，通過激活細胞內散落蛋白(DSH)來激活GSK-3β結合蛋白(GBP)，而GBP可以抑制GSK3β對β-catenin的磷酸化，進而抑制β-catenin降解，使胞質內的β-catenin得以穩定并不斷積累入核，調節靶基因的轉錄和表達[14]。可見LRP5、GSK-3β及β-catenin是wnt/β-catenin信號通路的重要節點。RUNX2能通過上調骨鈣素、I型膠原、骨橋蛋白等基因的轉錄來實現BMSCs的成骨分化[15]，而Osterix是處在RUNX2下游的成骨分化關鍵調控因子。該通路還可以通過β-catenin增強wnt信號通路的靶基因堿性磷酸(alkaline phosphatase,ALP)的轉錄來促進成骨分化。本研究顯示，BMSCs經成骨誘導7d后骨碎補含藥血清明顯上調β-catenin、LRP5、RUNX2及Osterix mRNA的表達，下調GSK-3β的表達，胞質中β-catenin、LRP5的蛋白表達水平升高，且中劑量組三者的表達量較其他組有明顯差異，提示骨碎補含藥血清通過激活Wnt/β-catenin信號通路，并提高該通路調控的RUNX2、Osterix mRNA表達及提高ALP的活性來實現BMSCs的成骨分化。

總之，本實驗分別從血清藥理學、細胞生物學、分子生物學3個角度對骨碎補含藥血清促進BMSCs成骨分化的機制進行探討，認為骨碎補含藥血清促進BMSCs成骨分化與wnt/β-catenin細胞通路的激活密切相關，但其具體作用機制仍需進一步研究。

(致謝：本實驗在山東中醫藥大學附屬眼科醫院眼科研究所完成，在此對實驗室各位老師的指導和幫助表示衷心的感謝！)

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Effect of Rhizoma drynariae drug-containing serum on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by wnt/beta-catenin signaling pathway

CHEN Yun-gang1, Tan Guo-qing2, REN Wei-long1, XU Zhan-wang1

(1.TheFirstclinicalMedicalCollege，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China;2.SpinalDeptofOrthopedics，theAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China)

Aim To investigate the drug-containing serum of Rhizoma drynariae on osteogenesis differentiation of bone marrow mesenchymal stem, and discuss the possible mechanism.Methods BMSCs were cultured in media with different concentrations of medicine containing serum．BMSCs proliferation ability was detected in 3,5,7,9 days by CCK-8. ALP activity was detected after 7,10,14 days′ induction. After 3 weeks culturing, alizarin red staining was performed to observe the formation of calcium nodules. The expression of β-catenin,LRP5,RUNX-2 and Osteriex mRNA were detected using RT-PCR. The protein expression of β-catenin,LRP5 was detected using Elisa method.Results Rhizoma drynariae drug-containing serum could obviously promote the proliferation of BMSCs and calci-fied nodule formation.Besides, the ALP activity was improved in a certain period of time. The expression of β-catenin,LRP5,GSK-3β,RUNX-2 and Osteriex mRNA were significantly up-regulated,and the protein expression of β-catenin,LRP5 was up-regulated too. The expression of GSK-3β was down-trgulated. Conclusions Rhizoma drynariae drug-containing serum promotes mineralization and osteogenic differentiationof BMSCs, and the mechanism is closely related with activating WNT/beta-catenin signaling pathway, raising the beta-catenin, LRP5, RUNX-2, and Osteriex mRNA expression， beta-catenin, LRP5 protein expression，and down-regulation of GSK-3β mRNA expression.

Rhizoma drynariae; containing serum;bone marrow mesenchymal stem cells; wnt/β-catenin; proliferation; alkaline phosphatase; osteogenesis differentiation

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.034.html

2017-01-17,

2017-02-08

國家自然科學基金資助項目(No 81473709)

陳云剛(1984-)，男，博士生，研究方向：脊柱脊髓損傷，脊柱退行性疾病的基礎與臨床，E-mail:chen_yungang@163.com； 徐展望(1960-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：脊柱脊髓損傷，脊柱退行性疾病的基礎與臨床, 通訊作者, E-mail:xzw6001@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.017

A

1001-1978(2017)06-0830-07

R-332；R282.71；R329.24；R336；R681；R977.3