塞來昔布對顱腦創(chuàng)傷后Caspase-9表達及運動功能的影響

張 濤，國建飛，邢琳琳，張金玲， 鄭 麗， 李喜朋，張宇新

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 邢臺 054031；2.邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系， 河北 邢臺 054031；3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

塞來昔布對顱腦創(chuàng)傷后Caspase-9表達及運動功能的影響

張 濤1，國建飛1，邢琳琳1，張金玲2， 鄭 麗2， 李喜朋1，張宇新3

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 邢臺 054031；2.邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系， 河北 邢臺 054031；3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

目的 探討塞來昔布對大鼠顱腦創(chuàng)傷后環(huán)氧合酶(COX-2)和凋亡蛋白Caspase-9表達及運動功能的影響。方法 實驗分為對照組、假手術(shù)組、創(chuàng)傷組、治療組，采用Marmarou方法建立大鼠閉合性顱腦創(chuàng)傷模型，實時熒光定量PCR(qPCR)檢測COX-2和Caspase-9基因表達量，免疫組織化學(xué)染色法檢測COX-2和Caspase-9蛋白的表達，神經(jīng)功能損害評分(NSS)檢測大鼠的運動功能。結(jié)果 創(chuàng)傷組COX-2和Caspase-9基因和蛋白的表達明顯高于其他3組(P<0.05)，治療組較創(chuàng)傷組能有效降低COX-2和Caspase-9的表達，但仍高于假手術(shù)組和正常組(P<0.05)；與創(chuàng)傷組相比較，治療組能有效改善大鼠的運動功能障礙(P<0.05)，和對照組和假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 塞來昔布可通過對COX-2的特異性抑制作用，減少顱腦損傷后炎癥反應(yīng)，并進一步降低Caspase-9的表達，從而減少神經(jīng)細胞的凋亡，并改善大鼠顱腦創(chuàng)傷后的運動功能障礙。

塞來昔布；顱腦損傷；環(huán)氧化酶-2；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；凋亡；運動功能

近年來，環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在顱腦損傷中所起的作用受到學(xué)術(shù)界的普遍關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后COX-2表達改變與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)，COX-2作為一種重要的炎癥介質(zhì)，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成血栓素和前列腺素，從而使炎性因子和氧自由基產(chǎn)生過多，進一步造成代謝紊亂、細胞損傷和細胞凋亡[1]。本課題組前期已證實塞來昔布可通過降低COX-2和Caspase-3、Apaf-1的表達，抑制腦損傷后的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細胞凋亡，具有保護腦組織的作用[2-3]。本研究繼續(xù)以COX-2為藥物作用靶點，選用塞來昔布干預(yù)，觀察藥物治療對顱腦創(chuàng)傷后凋亡Caspase-9因子及運動能力的影響，以探討塞來昔布的神經(jīng)保護效應(yīng)，為臨床防治顱腦創(chuàng)傷時應(yīng)用新的非甾體類抗炎藥提供實驗依據(jù)。也為探索并實施顱腦創(chuàng)傷后抗細胞凋亡腦保護治療策略提供部分參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 72只SPF級6周齡成年SD大鼠，體質(zhì)量(280±20)g，訂購于北京華維通利華實驗動物科技股份有限公司，許可證號：SCXX(京)2013-0008，常規(guī)飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF屏障環(huán)境(動物合格證號：醫(yī)動字第410117號)。塞來昔布(250 mg·kg-1)購置于美國輝瑞制藥有限生物公司；PCR試劑盒購、組織裂解液于美國Invitrogen公司；兔抗大鼠COX-2和Caspase-9多克隆抗體及生物素標記二抗均購置于北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與動物模型制備 依照隨機數(shù)字表法將實驗動物分為治療組、創(chuàng)傷組、假手術(shù)組和對照組，每組12只，用于qPCR和免疫組織化學(xué)染色法檢測使用。另取24只SD大鼠每組6只進行NSS評分。用10%水合氯醛腹腔注射大鼠，麻醉成功后，75%乙醇消毒手術(shù)區(qū)，治療組和創(chuàng)傷組參考Marmarou等[4]操作構(gòu)造大鼠重型彌漫性顱腦創(chuàng)傷模型，傷后立即給予人工輔助呼吸及傷口清創(chuàng)縫合；假手術(shù)組僅給予頭皮切開縫合，不做其他處理；對照組不給予任何處置。術(shù)后SPF級環(huán)境正常飼養(yǎng)，治療組創(chuàng)傷后即刻給予塞來昔布腹腔內(nèi)注射1次，以后每6 h給藥1次。同時，對照組、假手術(shù)組和創(chuàng)傷組給于同等量的PBS腹腔注射。

1.2.2 標本制備 各組大鼠模型制備完成后，于72 h后給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用250 mL生理鹽水行心臟灌注，然后繼續(xù)用500 mL 4%多聚甲醛進行灌注，可見大鼠出現(xiàn)強直僵硬，然后斷頭取腦，以視交叉為中心，冠狀位水平切5 mm左右腦片，取出腦組織海馬區(qū)，部分入4%多聚甲醛固定，組織經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明后進行石蠟包埋，石蠟橫切片，片厚5 μm，貼附于載玻片至37℃恒溫箱烘烤后常溫保存。另將取部分腦組織放置于凍存管中，投入液氮速凍，以備qPCR檢測使用。

1.2.3 實時定量熒光PCR檢測COX-2和Caspase-9基因表達水平 取80 mg制備的大鼠腦組織，加入400 μL ERSR裂解液，用勻漿機勻漿之后，參照TRIzol說明書一步法提取組織總RNA，于紫外分光光度計測定RNA純度及濃度復(fù)合實驗要求后，用M-MLV試劑盒將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA后，再使用SYBR試劑盒進行PCR擴增反應(yīng)，COX-2引物上游：5′-CTTTTGGACTGCTGCTTTGCTG-3′；下游：5′-GTCCCCTGAAAGGTTTGGAAT-3′，Caspase-9引物上游：5′-CTGTTGGACTGCTGCTTTGCTG-3′，下游：5′-GTCTCCTGAAAGGTTTGGAAT-3′；β-actin為上5′-GTTGGGACCTGAGAGACTA-3′；下游：5′-TGGCGATGTCCAGTCACACT-3′。擴增條件：96℃預(yù)變性10 min，96℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后再72℃延伸10 min。實驗結(jié)果采用相對定量的方法進行分析。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測COX-2和Caspase-9蛋白的表達 組織載玻片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鈉緩沖液(SSC)高壓抗原修復(fù)2 min，PBS洗3次，每次8 min，滴加適量3% H2O2至蓋玻片上，室溫孵育15 min，達到阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的作用，然后用蒸餾水洗3次，每次5 min。滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，并將多余液體甩去，滴加稀釋(1 ∶100)的COX-2和Caspase-9一抗，4℃冰箱過夜，然后PBS洗3次，每次2 min，滴加生物素標記羊抗兔IgG，37℃，20 min，PBS洗3次，每次2 min。滴加SABC試劑，37℃，20 min，PBS洗4次，每次5 min。室溫下DAB顯色，并在鏡下控制反應(yīng)時間，用蒸餾水洗滌。蘇木精復(fù)染2 min，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察并拍照進行圖像分析。

1.2.5 神經(jīng)功能損害評分(NSS) SD大鼠顱腦損傷后，于創(chuàng)傷后d 10開始對其進行神經(jīng)運動障礙評分檢測，按照Teng等[5]操作方法，檢測內(nèi)容包括對大鼠運動、反應(yīng)、感覺以及平衡能力等評估。分值越低表示神經(jīng)運動功能越正常，嚴重神經(jīng)功能障礙(≥15分)，神經(jīng)狀態(tài)接近正常(≤10分)，共25分。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 各組COX-2和Caspase-9的mRNA表達量(Tab 1)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析：創(chuàng)傷組COX-2和Caspase-9的mRNA表達量明顯高于其他各組(P<0.05)；治療組與創(chuàng)傷組相比較COX-2和Caspase-9的mRNA表達量有所降低(P<0.05)，但仍高于對照組及假手術(shù)組(P<0.05)；假手術(shù)組與對照組之間兩者的表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

GroupCOX-2Caspase-9Treatment1.69±4.62*1.60±1.27*Trauma2.18±5.24#2.08±8.02#Shamoperation1.27±2.101.20±6.14Control1.10±6.961.12±4.83F15.7314.02P0.010.00

#P<0.05vscontrol,sham operation treatment;*P<0.05vstrauma, sham operation and control

2.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)果 腦組織海馬區(qū)COX-2和Caspase-9蛋白表達于神經(jīng)細胞胞質(zhì)，陽性反應(yīng)呈棕黃色顆粒。各組COX-2和Caspase-9蛋白表達(Tab 2，F(xiàn)ig 1、2)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析：創(chuàng)傷組COX-2和Caspase-9的蛋白表達量明顯高于其他3組(P<0.05)；治療組與創(chuàng)傷組相比較，COX-2和Caspase-9的蛋白表達量有所降低(P<0.05)，但仍高于對照組及假手術(shù)組(P<0.05)，對照組和假手術(shù)組之間兩者的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 2 Expression of COX-2 and Caspase-9 protein

GroupCOX-2Caspase-9Treatment79.46±5.62*25.70±1.27*Trauma95.98±6.24#34.70±6.02#Shamoperation70.27±3.1023.39±8.14Control68.16±2.9618.31±4.53F28.7316.52P0.000.01

#P<0.05vscontrol,sham operation and treatment;*P<0.05vstrauma, sham operation and control

2.3 NSS評分結(jié)果 神經(jīng)運動障礙評分檢測發(fā)現(xiàn)，治療組、創(chuàng)傷組、假手術(shù)組、對照組NSS評分分別為7.97±3.49、17.26±4.56、1.13±0.24、0.96±0.37(F=56.28，P<0.05)，創(chuàng)傷組相較于其他各組NNS評分明顯增加(P<0.05)，治療組較創(chuàng)傷組NNS評分有所降低(P<0.05)，但仍高于對照組及假手術(shù)組(P<0.05)，對照組與假手術(shù)組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 1 Expression of COX-2 protein detected by immunohistochemical staining(×200)

A:Control group；B：Sham operation group；C：Trauma group；D：treatment group

Fig 2 Expression of Caspase-9 protein detected by immunohistochemical staining(×200)

A:Control group；B：Sham operation group；C：Trauma group；D：treatment group

3 討論

COX-2通過炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性神經(jīng)元死亡過程中發(fā)揮著極其重要的作用，炎癥反應(yīng)是引發(fā)神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的重要原因之一，因此減少炎癥反應(yīng)所引發(fā)的繼發(fā)性腦損傷顯得尤為重要[6-7]。COX-2是前列腺素合成過程中的重要限速酶，其可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為血管活性前列腺素前體物質(zhì)，使NO、IL-1及TNF-α等增加，進而引起脂質(zhì)過氧化，DNA損傷和細胞膜破壞，減弱血管內(nèi)皮細胞的血管舒張反應(yīng)性，造成細胞損傷、代謝紊亂、血管功能障礙，從而引發(fā)神經(jīng)細胞丟凋亡[8-10]。一些學(xué)者認為，COX-2在腦創(chuàng)傷后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)和促進神經(jīng)細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷組COX-2 mRNA和蛋白的表達明顯高于其它各組(P<0.05)，塞來昔布藥物治療組較創(chuàng)傷組能明顯降低COX-2 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)，創(chuàng)傷組相較于其他各組NNS評分明顯增加(P<0.05)，塞來昔布藥物治療組較創(chuàng)傷組NNS評分有所降低(P<0.05)。前期研究發(fā)現(xiàn)，腦創(chuàng)傷后COX-2明顯增高，COX-2抑制劑可以降低COX-2的表達，COX-2與腦創(chuàng)傷后引發(fā)的繼發(fā)性腦損傷密切相關(guān)，COX-2抑制劑能夠明顯改善大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后學(xué)習(xí)記憶障礙[12]。Strauss等[13]研究發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷后COX-2的持續(xù)性高表達會導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)物的堆積，進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Cysteine aspartate protease-9，Caspase-9)是Caspase凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)的啟動性蛋白酶，位于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的上游，Caspases與細胞凋亡關(guān)系密切。在顱腦創(chuàng)傷后缺血缺氧性腦損傷的過程中發(fā)揮著極其重要的作用。Caspase-9調(diào)節(jié)細胞內(nèi)源性凋亡途徑，由細胞線粒體中的細胞色素氧化酶C在dATP或ATP參與下，其釋放到細胞胞質(zhì)，與Caspase-9、凋亡激活因子(Apaf-1)及dATP形成凋亡體，從而介導(dǎo)激活caspase級聯(lián)反應(yīng)[14-15]。激活Caspase-3，進一步激活DNA酶，導(dǎo)致DNA降解和染色體濃縮，引起細胞凋亡[16]。由此可見Caspase-9是Caspase級聯(lián)瀑布反應(yīng)的啟動蛋白酶，在顱腦損傷后的細胞凋亡中起重要作用。Li等[17]發(fā)現(xiàn)Caspase-9在大鼠顱腦缺氧缺血損傷后24 h的海馬和皮質(zhì)區(qū)呈高表達狀態(tài)；同樣，Yakovlev等[18]在大鼠液壓顱腦損傷模型中發(fā)現(xiàn)，Caspase-9在大腦海馬和皮層區(qū)高表達，并持續(xù)達48 h以上。李志恒等[19]采用免疫組織化學(xué)SP方法、ELISA和圖像分析技術(shù)觀測大鼠顱腦外傷后不同時間段血清中Caspase-9的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caspase-9的表達呈現(xiàn)出上升-高峰-逐漸下降的規(guī)律性變化。

本研究采用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)法同樣發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷組Caspase-9 mRNA和蛋白表達明顯高于其他各組，同時給予選擇性COX-2的特異劑塞來昔布藥物治療能有效降低Caspase-9 mRNA和蛋白的表達，并且神經(jīng)功能損害評分(NSS)檢測發(fā)現(xiàn)治療組能有效改善大鼠的運動功能障礙，說明塞來昔布可通過對COX-2的特異性抑制，減少由其引發(fā)的炎癥反應(yīng)，進一步降低Caspase-9的表達，從而減少神經(jīng)細胞的凋亡，并改善大鼠腦創(chuàng)傷后的運動功能障礙。同時前期本課題前期研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布通過降低COX-2、Caspase-3的表達，抑制腦損傷后的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，能夠改善腦創(chuàng)傷后的學(xué)習(xí)記憶障礙[3]。余娟等[20]在大鼠腦動脈閉塞模型實驗中發(fā)現(xiàn)，羅非昔布可通過促進腦缺血區(qū)神經(jīng)元Bcl-2過量表達，同時減少Bax的表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡。

COX-2通過多種途徑介導(dǎo)繼發(fā)性顱腦損傷后的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等的病理過程，但其確切機制尚不十分清楚。因此，進一步研究COX-2在繼發(fā)性顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)細胞凋亡的作用機制，以及COX-2抑制劑對腦損傷的保護作用，可為創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床診治提供新的參考。

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Effects of celecoxib on expression of caspase-9 and motor function after craniocerebral injury

ZHANG Tao1，GUO Jian-fei1，XING Lin-lin1，ZHANG Jin-ling2，ZHENG Li2, LI Peng-xi1，ZHANG Yu-xin3

(1.TheAffiliatedXingtaiPeople′sHospital，HebeiMedicalUniversity，XingtaiHeibei054031，China；2.CollegeofPharmacy，XingtaiMedicalCollege，XingtaiHeibei054031，China；3.SchoolofBasicMedicalScience，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，TangshanHeibei063000,China)

Aim To investigate the effects of celecoxib on cyclooxygenase-2(COX-2) and caspase-9 expression and motor function after traumatic brain injury in rats.Methods The rats were divided into control group, sham operation group, trauma group and treatment group. The model of closed craniocerebral trauma was established by Marmarou method, the gene expression of COX-2 and Caspase-9 was detected by real-time quantitative PCR(qPCR), the protein expressions of COX-2 and Caspase-9 were detected by immunohistochemical staining, and the motor function of the rats was evaluated by the neurological impairment score(NSS).Results The gene and protein expression of COX-2 and Caspase-9 in traumatic group was significantly higher than in other three groups (P<0.05), the expression of COX-2 and Caspase-9 in treatment group was significantly lower than in traumatic group(P<0.05), but still higher than the sham operation group and the normal group(P<0.05); compared with the trauma group, the motor function of the treatment group could be effectively improve (P<0.05), but compared with the control group and the sham operation group, the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion Celecoxib can reduce the inflammatory response after craniocerebral injury by specific inhibition of COX-2, and further reduce the expression of Caspase-9, thereby reducing the apoptosis of nerve cells, and improving motor function after traumatic brain injury in rats.

celecoxib；craniocerebral trauma；cyclooxygenase 2；Caspase-9；apoptosis；motor function

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.050.html

2017-01-20,

2017-03-05

河北省自然科學(xué)基金項目(No C2004000689)；河北省博士基金項目(No 05547008D-4)；河北省科學(xué)技術(shù)與社會發(fā)展計劃項目(No 04276135)

張 濤(1979-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：顱腦損傷的治療，通訊作者，E-mail：locust656@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.025

A

1001-1978(2017)06-0873-05

R-332；R332.81；R329.25；R651.1；R977.3