糖皮質激素對小膠質細胞內鈣的影響

何舒翹,錢 旭,張貴平,張維文,張 梅

(廣州醫科大學藥學院藥理教研室，廣州 廣東 511436)

糖皮質激素對小膠質細胞內鈣的影響

何舒翹,錢 旭,張貴平,張維文,張 梅

(廣州醫科大學藥學院藥理教研室，廣州 廣東 511436)

目的 觀察糖皮質激素對小膠質細胞內鈣的影響并初步探討其機制。方法 體外培養神經小膠質細胞株BV-2，使用Fluo3-AM作為鈣熒光染料，激光共聚焦顯微鏡實時掃描觀察氫化可的松處理后BV-2細胞內鈣濃度的動態變化情況。結果 氫化可的松和陽性對照藥尼古丁均能顯著升高BV-2細胞內鈣水平(P<0.05)；實時掃描顯示氫化可的松即刻引起細胞內鈣升高，15 s左右達到峰值，持續約10 s后開始下降，200 s左右恢復至基態，并且這一作用顯示出與尼古丁升高細胞內鈣效應的一致性。糖皮質激素受體拮抗劑RU486不能取消氫化可的松升高BV-2細胞內鈣的效應(P>0.05)；而α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)阻斷劑甲基牛扁亭堿(MLA)可以拮抗氫化可的松升高BV-2細胞內鈣的效應(P<0.05)。結論 氫化可的松通過影響α7nAChR升高小膠質細胞內鈣水平，這一作用不但證實了糖皮質激素的非基因組效應，同時提示糖皮質激素可能作為α7nAChR的內源性配體。

糖皮質激素；小膠質細胞；α7nAChR；尼古丁；甲基牛扁亭堿

糖皮質激素(glucocorticoids, GCs)是腎上腺皮質分泌的內源性分子，具有抗炎、抑制免疫反應等多種作用，是臨床廣泛使用的抗炎藥物。傳統觀點認為藥理劑量GCs才具有抗炎作用，但近年的研究表明內源性(或生理濃度)GCs同樣具有抗炎效應，并且在很多炎癥相關性疾病的發生發展中起重要作用[1-2]。GCs是體液抗炎系統的重要組成部分，而神經抗炎機制——膽堿能抗炎通路的發現進一步豐富了機體內源性抗炎系統的內涵。介導膽堿能抗炎通路的是迷走神經，其通過遞質乙酰膽堿作用于免疫細胞，抑制炎癥因子釋放起到抗炎作用，研究發現α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)處于膽堿能抗炎通路的核心，是該通路調控炎癥反應的關鍵分子[3]。我們前期發現，生理濃度GCs可以抑制LPS刺激小膠質細胞引起的炎癥反應，并且α7nAChR的特異性阻斷劑甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine，MLA)可拮抗GCs的這一作用，提示GCs的抗炎作用與α7nAChR有關，兩條內源性抗炎通路之間可能存在聯系[4]。

α7nAChR是煙堿型膽堿能受體家族的一員，由5個α7亞基構成同源聚合體，為促離子型受體，屬于配體門控的離子通道[5]。α7nAChR開放時可以通過鈉、鉀和鈣離子，尤其對鈣離子具有高度通透性，可影響細胞內鈣離子濃度，屬于高鈣依賴性離子通道[5]。GCs的經典作用模式是通過與糖皮質激素受體結合影響基因轉錄而發揮抗炎作用。我們的研究顯示GCs的抗炎作用與膽堿能通路α7nAChR有關，但這一作用是否通過GCs直接影響α7nAChR功能，尚不得而知。鑒于α7nAChR是高鈣通透性離子通道，本研究擬通過檢測小膠質細胞內鈣離子濃度變化，借此反映α7nAChR開放情況，揭示GCs是否作為內源性配體影響α7nAChR功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 神經小膠質細胞株BV-2由中科院上海細胞庫提供。BV-2細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，置于37℃、5% CO2培養箱，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖培養基、胎牛血清和胰酶均購自Gibco公司；HBSS緩沖液(含Ca2+、Mg2+)購自索萊寶公司；Fluo3-AM為日本同仁化學研究所產品；氫化可的松(hydrocortisone，Hydro)、尼古丁(nicotine，Nic)、MLA和DMSO來自Sigma公司；RU486為MCE 公司產品。激光共聚焦顯微鏡(A1ver 4.30)為Nikon公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥物處理和實驗分組 實驗分組主要包括control、Hydro、Hydro+RU486、Hydro+MLA和Nic組，在此Nic作為陽性對照藥。藥物的工作濃度：Hydro為300 nmol·L-1，Nic為50 μmol·L-1，糖皮質激素受體阻斷劑RU486為100 nmol·L-1，α7nAChR阻斷劑MLA為10 nmol·L-1。受體阻斷劑預先孵育細胞30 min后給予藥物處理。另單獨設立MLA和RU486組觀察對細胞內鈣的影響。

Fig 1 The effect of hydrocortisone on intracellular calcium in BV-2 cells

A a:Untreated cells;b:Cells were treated with hydrocortisone;c:Cells were treated with nicotine. B Statistical analysis for peak amplitude of[Ca2+]iafter drug treatment.*P<0.05vscontrol

1.2.2 Fluo3-AM負載細胞 BV-2細胞接種于共聚焦專用小皿，HBSS溶液洗滌細胞后加入Fluo3-AM工作液(2.5 μmol·L-1)，于37℃避光孵育30 min后除去Fluo3-AM，用HBSS溶液洗滌細胞3次備用。

1.2.3 BV-2細胞內Ca2+熒光量動態變化測定 激光共聚焦系統的測量參數：激發波長為488 nm，發射波長為526 nm；設置掃描的全時程為5 min，掃描間隔為每5 s一次，掃描至1.5 min時加入藥物，于第5 min停止掃描。對掃描過程中細胞內鈣水平變化的時間曲線進行分析：細胞內鈣水平的達峰時間、峰值持續時間和恢復基態時間。使用激光共聚焦系統的NIS-Elements AR Analysis 4.40.00 64-bit軟件分析細胞內鈣熒光強度。

Fig 2 Dynamics of intracellular calcium in response to Hydro and Nic in BV-2 cells

A:The instantaneous[Ca2+]icurve after drug treatment;B:Statistical analysis for dynamic change of[Ca2+]iafter drug treatment

2 結果

2.1 Hydro對小膠質細胞內鈣的影響 激光共聚焦顯微鏡實時掃描顯示，Fluo3-AM負載的BV-2細胞在給予Hydro和Nic(Fig 1A)后胞內綠色熒光明顯增強，而對照組細胞內無明顯綠色熒光。胞質內鈣熒光強度掃描分析顯示，Hydro和Nic均可引起BV-2細胞內鈣的明顯升高(P<0.05)(Fig 1B)。

2.2 Hydro對小膠質細胞內鈣動態變化過程的影響 激光共聚焦顯微鏡實時掃描BV-2細胞內鈣的動態變化，鈣濃度變化的經時曲線顯示在加入Hydro和Nic后細胞內鈣立刻開始升高：Hydro引起的細胞內鈣升高在15 s左右達到峰值，持續約10 s后開始下降；Nic引起的細胞內鈣升高在28 s左右達到峰值，持續約30 s后下降(Fig 2B)。兩者引起的細胞內鈣升高均在200 s左右恢復至基態(Fig 2B)。

2.3 RU486對Hydro升高小膠質細胞內鈣的影響 為了探明Hydro引起BV-2細胞內鈣上升的原因，在Hydro處理前預先給予糖皮質激素受體阻斷劑RU486孵育，結果顯示RU486不能拮抗Hydro升高BV-2細胞內鈣的效應(P>0.05)(Fig 3)。此外，RU486單獨使用并不影響BV-2細胞內鈣水平(Fig 3)。

2.4 MLA對Hydro升高小膠質細胞內鈣的影響 為了揭示Hydro引起BV-2細胞內鈣上升是否由α7nAChR介導，在Hydro處理前預先給予α7nAChR受體阻斷劑MLA孵育，結果顯示Hydro升高BV-2細胞內鈣的效應被MLA拮抗(Fig 4)(P<0.05)。MLA單獨使用并不影響BV-2細胞內鈣水平(Fig 4)。

Fig 3 Effect of RU486 on elevation of intracellular calcium induced by hydrocortisone in BV-2 cells

A a: Untreated cells;b:Cells were treated with hydro;c:Cells were treated with hydro after RU486;d: Cells were treated with RU486 only.B The dynamics of intracellular calcium in response to drug indicated.*P<0.05vscontrol

3 討論

小膠質細胞是中樞神經系統內的巨噬細胞，參與一系列免疫反應，尤其是在腦內炎癥反應過程中起重要作用。小膠質細胞上有含量豐富的糖皮質激素受體(GRs)，亦大量表達α7nAChR，不僅是GCs的直接抗炎靶標，也是聯接GCs(體液抗炎系統)和膽堿能抗炎通路的重要樞紐。我們前期在小膠質細胞的研究表明α7nAChR參與了生理濃度GCs的抗炎作用，但GCs如何影響α7nAChR功能卻不清楚。α7nAChR是高鈣通透性的陽離子通道，在激動劑的作用下離子通道開放，使細胞內鈣水平升高，鈣離子內流可引發細胞內一系列的下游信號事件，產生諸多生物效應。

Fig 4 Effect of MLA on the elevation of intracellular calcium induced by hydrocortisone in BV-2 cells

A a: Untreated cells;b:Cells were treated with hydro;c:Cells were treated with hydro after MLA;d:Cells were treated with MLA only. B The dynamics of intracellular calcium in response to drug indicated.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vshydrocortisone

本研究中使用激光共聚焦顯微鏡對BV-2細胞內鈣的變化進行實時觀察，結果顯示在加入氫化可的松和尼古丁后細胞內鈣立刻開始升高，氫化可的松較尼古丁達峰時間稍快，但尼古丁引起細胞內鈣上升的峰值更高，持續時間更長，兩者引起的細胞內鈣升高均在200 s左右恢復至基態。尼古丁是煙堿受體的特異激動劑，研究顯示其通過激動α7nAChR開放離子通道使細胞內鈣升高，發揮對多巴胺神經元的保護作用[6]。我們的結果證實糖皮質激素可以引起小膠質細胞內鈣濃度升高，并且這一作用顯示出與尼古丁升高細胞內鈣效應特征的一致性。有關糖皮質激素對細胞內鈣的影響，結果不盡相同。在脊髓背根神經元的研究顯示，皮質酮可以抑制ATP引起的細胞內鈣升高，并認為這一作用與PKA通路有關[7]；在海馬神經元的研究顯示，生理濃度的皮質酮可以增強細胞去極化引起的鈣內流，且這一作用與影響轉錄有關[8]。但上述研究結果均未證實皮質酮通過作用于離子通道影響細胞內鈣。

為了探明氫化可的松引起BV-2細胞內鈣上升的原因，我們分別預先給予GRs和α7nAChR的阻斷劑，觀察氫化可的松對細胞內鈣的影響，發現阻斷GRs并不影響細胞內鈣的變化，而α7nAChR阻斷劑可拮抗氫化可的松升高細胞內鈣的效應。這一結果說明氫化可的松引起小膠質細胞內鈣升高的效應并不是通過其傳統的受體途徑實現，而是通過促進α7nAChR開放引起細胞外的鈣離子內流所致。有關GCs和α7nAChR關系研究的報道一直不多。早年對小鼠大腦的放射顯影測定顯示，血漿皮質酮水平變化可影響多個腦區α7nAChR數目[9]；隨后在腎上腺嗜鉻細胞的研究證明GCs通過早期生長反應因子參與對α7nAChR基因啟動子的調節[10]。但作為小膠質細胞上重要的抗炎靶點，α7nAChR和GCs的關系一直未見報道。本研究顯示GCs通過作用于α7nAChR引起細胞內鈣離子濃度增加，不僅證實和拓展了GCs藥理作用的非基因組效應，提示GCs可作為α7nAChR的內源性配體發揮抗炎作用；并且首次在小膠質細胞揭示以GCs為代表的體液抗炎通路和膽堿能抗炎通路之間存在聯系，而α7nAChR作為這一連接的關鍵分子。最近的研究顯示可利用同源建模的方式研究鈣離子通道的三維結構[11]。GCs與小膠質細胞α7nAChR的結合形式是否可通過這種同源建模的方式進行探索，是值得本研究去嘗試的方法。此外，體液和膽堿能抗炎通路如何在體內協同發揮作用，尚需在后續的研究工作中進行闡明。

(致謝：本研究在廣州醫科大學藥學院藥理學廣州市重點實驗室完成，特此致謝！)

[1] He Y H, Zhang H N, Zhang G P, et al. A physiological concentration of glucocorticoid inhibits the pro-inflammatory cytokine-induced proliferation of adult rat cardiac fibroblasts: roles of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and nuclear factor-κB[J].ClinExpPharmacolPhysiol, 2011, 38(11):739-46.

[2] Zhang H N,He Y H,Zhang G S, et al. Endogenous glucocorticoids inhibit myocardial inflammation induced by lipopolysaccharide: involvement of regulation of histone deacetylation[J].JCardiovascPharmacol,2012,60(1):33-41.

[3] Wang H, Yu M, Ochani M, et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation[J].Nature,2003,421:384-8.

[4] 陳依雨, 呂俊華, 張 梅.α7nAChR參與生理濃度糖皮質激素的抗炎作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(4): 706-10.

[4] Chen Y Y, Lyu J H, Zhang M.α7nAChR involved in anti-inflammation of physiological concentration of glucocorticoids[J].ChinJPathophys, 2014, 30(4):706-10.

[5] Amiri S,Tai K,Beckstein O,et al. The alpha7 nicotinic acetylcholine receptor: molecular modelling, electrostatics, and energetics[J].MolMembrBiol, 2005, 22(3):151-62.

[6] Toulorge D, Guerreiro S, Hild A, et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2+[J].FasebJ, 2011, 25(8):2563-73.

[7] Liu X, Zeng J, Zhao Y, et al. Inhibition of ATP-induced Ca2+influx by corticosterone in dorsal root ganglion neurons[J].NeurochemRes, 2010, 35(5):804-10.

[8] Chatterjee S, Sikdar S K. Corticosterone targets distinct steps of synaptic transmission via concentration specific activation of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors[J].JNeurochem, 2014, 128(4):476-90.

[9] Stitzel J A, Farnham D A, Collins A C. Chronic corticosterone treatment elicits dose-dependent changes in mouse brain alpha-bungarotoxin binding[J].Neuroscience, 1996, 72(3):791-9.

[10]Carrasco-Serrano C, Campos-Caro A, Viniegra S, et al. GC-and E-box motifs as regulatory elements in the proximal promoter region of the neuronal nicotinic receptor alpha7 subunit gene[J].JBiolChem, 1998, 273(32):20021-8.

[11]雷 明, 蘇敬陽, 李 卓,等. Cav1.2鈣離子通道三維結構的同源建模及其應用[J]. 中國藥理學通報,2017, 33(1): 95-9.

[11]Lei M, Su J Y, Li Z, et al. Homology modeling and application of three dimensional structure of Cav1.2 calcium channel[J].ChinPharmacolBull, 2017, 33(1): 95-9.

Effects of glucocorticoids on intracellular calcium in microglial cells

HE Shu-qiao, QIAN Xu, ZHANG Gui-ping, ZHANG Wei-wen, ZHANG Mei

(DeptofPharmacology,SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China)

Aim To explore the effects of hydrocortisone on intracellular calcium in microglial cells.Methods The intracellular calcium was measured by instantaneous scanning with confocal laser microscope(CLM) in BV-2 cells, and fluo3-AM was used to dye the intracellular calcium.Results Both hydrocortisone and nicotine could obviously increase intracellular calcium in BV-2 cells(P<0.05). It was indicated by instantaneous scanning with CLM that hydrocortisone induced the rising of intracellular calcium immediately, and reached the peak about at the fifteenth second, and sustained for 10 seconds, then declined to baseline at 200th second. The effect of hydrocortisone on intracellular calcium exhibited a highly consistency with nicotine. Antagonist of glucocorticoid receptors RU486 could not abolish the rising of intracellular calcium induced by hydrocortisone(P>0.05); but the blocker of α7 nicotinic acetylcholine receptor(α7nAChR) methyllycaconitine could suppress the rising of intracellular calcium induced by hydrocortisone(P<0.05).Conclusion Hydrocortisone enhances intracellular calcium via α7nAChR in microglial cells, which not only demonstrates the non-genomic effect of glucocorticoid, but also suggests that glucocorticoid could serve as endogenous ligand of α7nAChR.

glucocorticoid；microglia；α7nAChR；calcium；nicotine；MLA

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.052.html

2016-12-15,

2017-01-10

廣東省科技計劃資助項目(No 2013B022000096)；廣東省自然科學基金資助項目(No 2016A030313568)

何舒翹(1991-)，女，碩士生，研究方向：神經藥理學,E-mail: 1547227027@qq.com； 張 梅(1971-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：神經藥理學,通訊作者,E-mail: zhmeic@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.026

A

1001-1978(2017)06-0878-06

R322.8；R348.1；R392.11；R977.11