以PNP酶為靶點的急性高尿酸血癥小鼠模型組建

楊旭娟，黃 茜，田 周，王 萍，李鵬輝，張建文

(昆藥集團股份有限公司 藥物研究院生物學部，云南 昆明 650100)

◇實驗方法學◇

以PNP酶為靶點的急性高尿酸血癥小鼠模型組建

楊旭娟，黃 茜，田 周，王 萍，李鵬輝，張建文

(昆藥集團股份有限公司 藥物研究院生物學部，云南 昆明 650100)

目的 建立一種新的急性高尿酸血癥小鼠模型并利用該模型對PNP酶抑制劑Ulodesine進行體內藥效作用評價。方法 小鼠腹腔注射肌苷(inosine)和皮下注射氧嗪酸鉀(oteracil potassium)誘導體內尿酸蓄積，在一定時間段內對小鼠進行內眥靜脈或摘眼球采血，測定血清尿酸值，判斷小鼠急性高尿酸血癥模型成功與否；再利用酶動力學分析Ulodesine對PNP酶的體外抑制作用，并于造模前給予小鼠灌胃Ulodesine，造模后測定血清尿酸值，評價Ulodesine的降血尿酸作用。結果 小鼠腹腔注射200 mg·kg-1肌苷聯合皮下注射200 mg·kg-1氧嗪酸鉀在1.5 h時能形成較為穩定的急性高尿酸血癥；酶動力學測定結果顯示Ulodesine對PNP酶有極強的抑制作用，其IC50值為2.293 nmol·L-1；另外，Ulodesine的體內藥效表明，Ulodesine能夠明顯減低急性高尿酸血癥小鼠體內尿酸水平。結論 我們已經成功地建立了一種新的急性高尿酸血癥小鼠模型，該造模制作方法更簡單有效，且該模型可以應用于驗證PNP酶抑制劑。

嘌呤核甘磷酸酶(PNP)；高尿酸血癥；Ulodesine：肌苷：小鼠；急性模型

正常嘌呤飲食狀態下，非同日兩次空腹血尿酸水平: 男>420 μmol·L-1，女>327 μmol·L-1，可診斷為高尿酸血癥(HUA)[1]。近年來，全球HUA發病率明顯增加，且發病年齡呈低齡化趨勢，研究表明HUA與高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、肥胖、胰島素抵抗的發生密切相關，已成為威脅人類健康的嚴重代謝性疾病。因此，控制尿酸水平是預防和治療HUA的關鍵。目前對高尿酸血癥的治療藥物主要包括三大類：抑制尿酸合成，促進尿酸排泄和促尿酸分解[2]。隨著分子生物技術的快速發展和人們對高尿酸血癥發病機制和遺傳學認識的日益加深，除去黃嘌呤氧化酶、尿酸轉運蛋白等[3]，新的治療靶點不斷被發現，新型治療藥物也相繼問世。以美國Biocryst公司研發的新型降血尿酸藥物Ulodesine為例，它是針對PNP酶高度專一的抑制劑，其降尿酸機制主要通過抑制嘌呤核甘磷酸酶(PNP)活性，進而減少次黃嘌呤及黃嘌呤在體內的積累，以達到降低血尿酸的目的[4]。隨著該藥二期臨床終點的到達，PNP靶點得到了廣泛關注[5-6]。

肌苷(Inosine)是體內尿酸合成的起始原料,經過PNP 酶的水解作用形成次黃嘌呤再由黃嘌呤氧化酶(XO)氧化形成黃嘌呤進而生成尿酸[7]。由此可見PNP處于XO的上游，評價PNP抑制對尿酸合成影響的體內模型需要使用上游底物肌苷而非次黃嘌呤。通過補充嘌呤類藥物(食物)建立的高血尿酸癥動物模型并不適用于評價PNP酶抑制劑的降尿酸效果[8]。因此，我們迫切需要建立一種新的高尿酸血癥動物模型，為靶向于PNP的新藥篩選及藥理藥效學評價提供一種可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級ICR ♂小鼠，體質量20～22 g，由昆藥集團實驗動物室提供，生產許可證號SCXK(滇)K2014-0001，使用許可證號：SYXK(滇)K2014-0001。

1.2 藥物與試劑 Ulodesine， 批號20150727，上海藥明康德；氯化鈉注射液，批號A141105 A1，昆明南疆制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，批號20121127，西安德立生物化工有限公司；尿酸(UA)測定試劑盒：批號：20151019，南京建成生物工程研究所；氧嗪酸鉀(Otp)：批號BJ0909DA14，上海源葉生物科技有限公司； 肌苷(inosine，Ino)，批號019K1124V,Sigma；黃嘌呤氧化酶，批號SLBB1574V，Sigma；嘌呤核甘磷酸酶，批號L16Y28A，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器 PowerWave XS2全波長酶標儀(BioTek)，MiniSpin離心機(eppendorf)，AdventurerTM天平(奧豪斯儀器上海有限公司)

1.4 Ulodesine對PNP酶的體外抑制作用 取50 μL不同濃度的Ulodesine溶液或空白溶液(50 mmol·L-1PBS)、50 U·L-1的PNP酶溶液、100 μL濃度為0.56 mmol·L-1肌苷底物(含XO濃度為0.165 kU·L-1)，依次加入到96孔板中，置于酶標儀檢測板上(全程溫度控制在在25 ℃)，中級震板10 s后在293 nm處每隔1 min測定吸光度值A，共計10 min；以吸光度值A對反應時間制作反應曲線，求出反應速率V。重復3次測定，取其平均值。

按下列公式計算Ulodesine對PNP酶的抑制率：抑制率(%)=[V(空白孔)-V(樣品孔)]/V(空白孔)×100%

1.5 急性高尿酸血癥小鼠模型的組建 取64只♂小鼠隨機分為8組，每組8只，分別為肌苷低、中、高劑量組(即Ino 100、200、300 mg·kg-1組)，聯合造模低、中、高劑量組(即Ino 100 mg·kg-1+Otp 200 mg·kg-1、Ino 200 mg·kg-1+Otp 200 mg·kg-1、Ino 300 mg·kg-1+Otp 200 mg·kg-1組)，氧嗪酸鉀組(Otp 200 mg·kg-1)、空白對照組(NS)，以上模型組中，按10 mL·kg-1容積腹腔(ip)注射肌苷或皮下(sc)注射氧嗪酸鉀造模，空白組分別腹腔聯合皮下給予等體積生理鹽水。以上各組分別在造模后1.5 h摘除小鼠眼球采血，室溫靜置30 min后，4 000 r·min-1離心10 min，取血清，按試劑盒方法(磷鎢酸法)測定尿酸值。為減小系統誤差，試驗采用平行操作。

1.6 Ulodesine體內降尿酸作用評價 取40只♂小鼠分為5組(每組8只)：空白組、模型組、Ulodesine(20、10、5 mg·kg-1)，均于造模前0.5 h按20 ml·kg-1體重灌胃給藥1次，空白組與模型組給予等體積0.5% CMC-Na溶液。各組均按200 mg·kg-1劑量腹腔注射肌苷聯合200 mg·kg-1劑量皮下注射氧嗪酸鉀造模，空白組給予等體積氯化鈉注射液。造模后1.5 h摘除小鼠眼球采血，室溫靜置30 min后，4 000 r·min-1離心10 min，取血清按試劑盒方法(磷鎢酸法)測定尿酸值。為減小系統誤差，試驗采用平行操作。

2 結果

2.1 Ulodesine對PNP酶的體外抑制作用 實驗結果顯示，在測定時間0～10 min范圍內，反應體系中隨著Ulodesine濃度的增大，反應速率越小，終濃度大于6.25 nmol·L-1時，抑制率高達90%；經過GraphPad Prism 6.0軟件對Ulodesine LogC-抑制率進行曲線擬合，IC50=2.293 nmol·L-1，見Tab 1及Fig 1。

Tab 1 Inhibition of Ulodesine on PNP

Fig 1 Fitting curve of Ulodesine inhibition rate to PNP

2.2 急性高尿酸血癥小鼠模型組建 實驗結果顯示，在1.5 h采血時間點，單用肌苷或氧嗪酸鉀造模，模型組動物血清尿酸水平與空白組不相上下，甚至低于空白組，造模并不理想，而二者聯合造模3個劑量組動物血清尿酸水平明顯高于空白組，差異具有統計學意義，提示模型均復制成功。且肌苷200 mg·kg-1聯合氧嗪酸鉀200 mg·kg-1造模與肌苷300 mg·kg-1聯合氧嗪酸鉀200 mg·kg-1造模相比，前者血清尿酸值略高；故綜合以上實驗情況，最終確定急性高尿酸小鼠造模條件為：肌苷(ip：200 mg·kg-1)聯合氧嗪酸鉀(SC：200 mg·kg-1)，于造模后1.5 h采血。見Tab 2、Fig 2。

2.3 Ulodesine體內降尿酸作用評價 結果顯示，模型組動物血清尿酸水平明顯高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.01)；Ulodesine各劑量組均能劑量依賴性降低模型小鼠血清尿酸水平，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。表明Ulodesine具有很好的降低模型小鼠血清尿酸作用，見Tab 3，Fig 3。

3 討論

根據增加尿酸的來源和減少其去路的原理，常用以下方法構建高尿酸血癥動物模型：① 直接攝入尿酸、高嘌呤食物或尿酸前體物質，增加黃嘌呤氧化酶的活性，促進尿酸產生，從而獲得高尿酸血癥模型；② 抑制尿酸的排泄: 體內的尿酸主要通過腎臟排出體外，抑制腎臟尿酸排泄，可以增加血尿酸濃度，形成高尿酸血癥;③ 抑制尿酸酶活性: 尿酸酶催化尿酸氧化成過氧化氫和尿囊素等物質，抑制或消除尿酸酶的活性是造模的主要手段，常用藥物為氧嗪酸鉀;④ 基因改造模型：1994年國外報道通過胚胎干細胞同源性重組，破壞小鼠尿酸酶基因，獲得尿酸酶缺乏的突變小鼠高尿酸血癥模型[8-9]。現有高尿酸血癥動物模型的建立方法很多，但尚無公認的最佳方法。因此應根據研究目的、實驗條件來選擇合適的造模動物和造模方法。

Tab 2 Effect of different doses of inosine combined with potassium oxonate modeling on uric acid level in ±s，n=8)

#P<0.05,##P<0.01vsvehicle

Tab 3 Effects of Ulodesine on the level

GroupDose/mg·kg-1Uricacidlevel/mg·L-1Decreasingrate/%2061.72±7.38##64.25Ulodesine1087.50±14.32##49.325106.25±42.00#38.46Model-172.66±18.47—Blank-54.17±16.02—

#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of different doses of inosine combined with potassium oxonate modeling on uric acid level in mice

1：Ino 100;2:Ino 200;3:Ino 300;4:Ino 100+Otp 200;5:Ino 200+Otp 200;6:Ino 300+Otp 200;7:Otp 200;8:NS,#P<0.05,##P<0.01vsNS

Fig 3 Effects of Ulodesine on level of uric acid in mice

1:U 20 mg·kg-1;2:U 10 mg·kg-1;3:U 5 mg·kg-1;4:Model group;5:Control group.#P<0.05,##P<0.01vsmodel

由于PNP酶處于XO酶的上游，評價PNP抑制劑對尿酸合成影響的體內模型需要使用上游底物肌苷而非次黃嘌呤。我們根據這些理論，從體內體外兩個方面分別驗證了Ulodesine對PNP酶的抑制作用及降尿酸作用。體外結果顯示在測定時間0～10 min范圍內，反應體系中隨著Ulodesine濃度的增大，反應速率越小，終濃度大于6.25 nmol·L-1時，抑制率高達90%，其IC50為2.293 nmol·L-1，表明Ulodesine對PNP酶具有極強的抑制作用；另外在肌苷聯合氧嗪酸鉀造模的新高尿酸血癥模型中，肌苷200 mg·kg-1聯合氧嗪酸鉀200 mg·kg-1造模在1.5 h時，小鼠血清尿酸值為空白組的4倍，與文獻報道的次黃嘌呤腹腔加氧嗪酸鉀皮下注射法形成急性小鼠高尿酸模型類似[10]，而 5～20 mg·kg-1的Ulodesine均能劑量依賴性降低模型小鼠血清尿酸水平，與模型組比，差異有統計學意義。以上實驗結果說明Ulodesine具有很好的降低高尿酸血癥模型小鼠尿酸水平的作用，與報道一致。且肌苷加氧嗪酸鉀造成的小鼠急性高尿酸血癥模型可用于評價以PNP為靶點的藥物的降尿酸效果。

該模型針對PNP靶點建立，由于PNP酶處于XO酶的上游，因此該模型不僅可以用于以PNP酶為靶點的降血尿酸藥物新藥開發，還可以用于評價以XO為靶點的藥物藥效學評價，以及尿酸生成過程中兩種作用機制不同藥物在體內的降血尿酸協同效應。

(致謝：參與實驗幫忙的實習生袁云云、郝世穎、蘇慧敏、劉威良。)

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Establishment of a novel hyperuricemia animal model using mice and assessment of hyporuricemia action of PNP inhibitor Ulodesine

YANG Xu-juan, HUANG Xi, TIAN Zhou, WANG Ping,LI Peng-hui, ZHANG Jian-wen

(KunmingPharmaceuticalGroupCorporation,BiologyDeptofInstituteofDrugDiscoveryandDevelopment,Kunming650100,China)

Aim To establish a novel acute hyperuricemia mouse model and apply it to evaluate the hyporucicemia effects of Ulodesine, a purine nucleoside phosphorylase(PNP) inhibitor.Methods The mice were intraperitoneal injected inosine and subcutaneous injected Oteracil potassium to induce accumulation of uric acid, and the animal blood was collected from eyeball or vena angularis in different time points.The levels of serum uric acid were measured and determined to test whether the acute hyperuricemia mouse model were successful or not. In order to verify the hyperuricemia seen in the model was associated with the accumulation of inosine, which was converted to uric acid by action of PNP,hyporucicemia effects of Ulodesine, a PNP inhibitor, was assessed in an enzyme assay and confirmed by using the newly established model.Result Accumulation of uric acid in the blood of mouse models was observed by combined injections of intraperitoneal 200 mg·kg-1inosine and subcutaneous 200 mg·kg-1Oteracil potassium respectively after 1.5 h. The enzyme assay indicated that Ulodesine was a potently PNP inhibitor with IC50of 2.293 nmol·L-1. IV injection of Ulodesine eliminated uric acid accumulations in blood of the mouse model, which was expected as theinvivoaction of Ulodesine.Conclusions A novel acute hyperuricemia mouse model is established. This is a relatively easy and more effective protocol to generate the hyperuricemia in mice, which will be a useful platform to assess the anti-hyperuricemia activity of PNP-target drugsinvivo.

purine nucleoside phosphorylase(PNP)；hyperuricemia；Ulodesine；inosine；mice；acute animal model

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.054.html

2017-01-07,

2017-03-25

云南省科技廳高層次科技創新人才計劃(No 2013HA018)

楊旭娟(1985-)，女，工程師，研究方向：心血管藥理學，E-mail：xujuan_0226@126.com; 張建文(1959-),男,博士，研究方向：心血管藥理學,通訊作者,E-mail：zhanguab@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.027

A

1001-1978(2017)06-0883-04

R-332；R363-332；R589.9；R977.3