缺氧通過刺激胸腺基質淋巴細胞生成素分泌促進宮頸癌細胞體外侵襲

常凱凱， 楊慧麗， 周文潔， 李明清， 謝 鋒

復旦大學附屬婦產科醫院研究所生殖免疫研究室，上海 200011

·論 著·

缺氧通過刺激胸腺基質淋巴細胞生成素分泌促進宮頸癌細胞體外侵襲

常凱凱， 楊慧麗， 周文潔， 李明清， 謝 鋒*

復旦大學附屬婦產科醫院研究所生殖免疫研究室，上海 200011

目的： 探討缺氧誘導宮頸癌細胞體外侵襲的可能調節機制。方法： 用ELISA法分析常氧和缺氧培養對宮頸癌細胞株HeLa和CaSki細胞的胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)分泌水平及TSLP對侵襲相關分子基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotein-2, MMP-2)、MMP-9和白細胞介素-8(interleukin-8, IL-8)表達水平的影響。Matrigel侵襲實驗分別檢測重組TSLP、缺氧和TSLP中和性抗體對宮頸癌細胞侵襲力的影響。結果： 與常氧環境相比，缺氧培養下HeLa、CaSki細胞TSLP分泌水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。重組TSLP(100 ng/mL)體外刺激顯著促進HeLa、CaSki細胞的侵襲力(P<0.001)，并促進其分泌MMP-2、MMP-9和IL-8(P<0.01)。缺氧培養可顯著促進HeLa、CaSki細胞的侵襲力(P<0.001)；TSLP中和性抗體(5 μg/mL)能抑制HeLa、CaSki細胞侵襲(P<0.05)，且可明顯抑制缺氧對HeLa、CaSki細胞侵襲力的促進作用(P<0.05)。結論： 缺氧可通過促進宮頸癌細胞分泌TSLP，促進宮頸癌細胞體外侵襲。

胸腺基質淋巴細胞生成素；缺氧；宮頸癌；侵襲

宮頸癌嚴重威脅婦女健康，每年全球有超過273 000人因宮頸癌而死亡，約占女性癌癥死亡總數的9%[1-4]。胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)是一種主要由上皮細胞產生的造血細胞因子，在皮膚、肺、胸腺、心臟、胃腸道、肝臟等器官高表達[5]。腫瘤細胞，如纖維母細胞瘤、肺癌、乳腺癌和胰腺癌細胞等，均分泌高水平TSLP。TSLP/TSLP受體(TSLPR)信號參與調節多種生理和病理過程，如調節天然和適應性免疫反應，并在呼吸道疾病、過敏性皮膚病、寄生蟲感染和腸道免疫調節中發揮重要作用。

前期研究已經發現宮頸癌細胞高水平表達TSLP，而TSLP可在體外增強宮頸癌細胞活力[6]、促進癌灶血管形成[7]，并可通過募集和調節癌灶嗜酸性粒細胞功能來促進宮頸癌進展[8]。但其是否參與調節宮頸癌細胞的侵襲仍不清楚。因此，本研究通過觀察體外缺氧環境對TSLP表達的調節作用及TSLP對宮頸癌細胞株HeLa及CaSki細胞的侵襲力和相關分子表達的影響，探討缺氧和TSLP在調節宮頸癌侵襲和轉移效應中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清和RPMI 1640培養基購自Gibco公司；人TSLP ELISA試劑盒、人重組TSLP蛋白(rhTSLP)、抗人TSLP中和性抗體(aTSLP)和對照IgG抗體均購自R&D公司；人基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9和白細胞介素-8(IL-8)ELISA試劑盒購自吉泰生物科技有限公司；Matrigel購自BD公司。

1.2 細胞來源及培養 人宮頸癌細胞株(HeLa和CaSki細胞)均購自中國科學院上海細胞庫。分別對HeLa和CaSki細胞進行常氧或缺氧培養。常氧培養的細胞放置于常氧培養箱中(培養條件：21% O2、74% N2、5% CO2)培養；缺氧培養的細胞放置于缺氧培養箱中(培養條件：1% O2、94% N2、5% CO2)培養。

1.3 ELISA法測定上清生化指標水平 用經正常培養和缺氧培養后的HeLa、CaSki細胞上清進行TSLP濃度檢測，將HeLa和CaSki細胞分別以每孔2×105個細胞接種于24孔板，同上法常氧或缺氧培養48 h。實驗終止后收集各組培養上清，按照TSLP的ELISA試劑盒說明書中的操作步驟，檢測各組上清中TSLP濃度。每次設3個復孔，實驗重復3次。

HeLa、CaSki細胞經rhTSLP處理后，檢測上清中MMP-2、MMP-9和IL-8濃度。將HeLa和CaSki細胞分別以每孔1×105個細胞接種于24孔板，給予溶媒或rhTSLP(100 ng/mL)刺激48 h后，收集培養上清，按照ELISA試劑盒的操作步驟檢測上清中MMP-2、MMP-9和IL-8的濃度。每次設3復孔，實驗重復3次。

1.4 Matrigel體外細胞侵襲實驗 按照細胞密度1×104/200 μL，將HeLa和CaSki細胞接種于Transwell培養小室(購自Corning公司，小室直徑為8 μm)，分別給予aTSLP或對照IgG抗體(5 μg/mL)，并于37℃、5%CO2常氧培養箱或缺氧培養箱中繼續孵育48 h后，用棉簽輕輕拭去培養小室的上室濾膜內面細胞，同時保留定向遷移至小室濾膜下表面的腫瘤細胞。隨后用4%多聚甲醛固定15 min，經PBS清洗后用蘇木精染色30 min。然后采用Olympus BX51+DP70熒光顯微鏡進行觀察，高倍顯微鏡(×200)計數侵襲細胞數量(每孔隨機選擇5個視野進行細胞計數)。侵襲指數=每高倍鏡視野中缺氧組遷移至濾膜下表面的細胞數/常氧組遷移至濾膜下表面的細胞數×100%。本實驗進行重復3次。

2 結 果

2.1 缺氧升高HeLa和CaSki細胞的TSLP分泌水平 相對于常氧條件，缺氧培養可明顯上調HeLa(圖1A，P<0.001)和CaSki細胞(圖1B，P<0.01)TSLP的分泌水平。結果提示缺氧可促進宮頸癌細胞分泌TSLP，宮頸癌組織高表達TSLP可能與癌灶局部缺氧有關。

圖1 缺氧培養促進HeLa(A)、CaSki細胞(B)分泌TSLP

2.2 重組TSLP促進HeLa和CaSki細胞侵襲 結果(圖2)表明：與對照組相比，重組TSLP蛋白刺激后，HeLa和CaSki細胞的侵襲力顯著升高(P<0.001)。

2.3 重組TSLP促進HeLa和CaSki細胞分泌MMP-2、MMP-9和IL-8 結果(圖3)表明：相對于對照組，重組TSLP蛋白刺激后，HeLa和CaSki細胞上清中MMP-2、MMP-9和IL-8濃度均顯著上升(P<0.01或P<0.001)。

2.4 缺氧通過上調TSLP分泌促進HeLa和CaSki細胞的侵襲力 結果(圖4)表明：相對于常氧組，缺氧組HeLa(P<0.001)和CaSki(P<0.001)細胞的侵襲力均顯著升高。但aTSLP處理抑制了HeLa(P<0.05)和CaSki(P<0.05)細胞的侵襲力，且aTSLP可明顯抑制缺氧培養對HeLa和CaSki細胞侵襲力的促進作用。

圖2 重組TSLP促進HeLa、CaSki細胞侵襲

圖3 重組TSLP促進HeLa、CaSki細胞分泌MMP-2、MMP-9和IL-8

圖4 缺氧通過上調TSLP分泌促進HeLa、CaSki細胞的侵襲力

3 討 論

缺氧是多種實體瘤的固有特征之一[9]。在腫瘤的形成過程中，一方面，腫瘤細胞的失控性增殖和生長使腫瘤細胞與周圍間質中血管間的距離逐漸增加；另一方面，腫瘤組織中新生血管結構和功能尚不完善且分布紊亂，使得腫瘤細胞不能獲得足夠的營養和氧氣。這些因素共同導致腫瘤組織存在缺氧微環境。研究[10]已證實，缺氧與宮頸癌低凋亡、高侵襲力、復發和不良預后等相關。我們的前期研究[11]發現，缺氧可通過促進IL-8分泌而促進宮頸癌細胞體外生長。缺氧還可增強宮頸癌細胞對放療的抵抗力[12]。如缺氧可通過促進缺氧誘導因子1α、血管內皮生長因子和p53的表達，引起放療后癌灶血管生成增多和腫瘤細胞自身凋亡水平降低[12]。

本研究發現缺氧條件下，宮頸癌細胞株HeLa、CaSki細胞分泌的TSLP水平均顯著升高，缺氧可能通過促進宮頸癌細胞分泌TSLP來進一步調節宮頸癌細胞的生物學行為。結合我們前期研究[6-7]發現，宮頸癌組織和細胞高表達TSLP，提示宮頸癌組織高表達TSLP可能與局部缺氧有關。

多種腫瘤細胞，如乳腺癌和肺癌細胞均高水平表達TSLP，而TSLP水平與腫瘤細胞的增殖和侵襲密切相關[13-14]。乳腺癌細胞通過表達TSLP可誘導樹突狀細胞(DCs)表達OX40L。原發性乳腺癌的浸潤灶中存在OX40L+DCs。這群OX40L+DCs可在體外誘導炎性Th2細胞分泌IL-13和腫瘤壞死因子(TNF)。我們既往已經報道TSLP可在體外增強滋養細胞增殖和侵襲力[6]。本研究證實重組TSLP蛋白可明顯促進HeLa、CaSki細胞侵襲。此外，缺氧亦促進HeLa和CaSki細胞侵襲，而且這一效應可以被TSLP中和性抗體所抑制，提示缺氧通過上調TSLP分泌促進宮頸癌體外侵襲。

前期研究[15]顯示，TSLP可以促進子宮內膜間質細胞分泌單核細胞趨化蛋白-1和IL-8，進而促進子宮內膜間質細胞體外增殖。除了IL-8[16]，大量的研究已經證實MMP-2和MMP-9可促進宮頸癌細胞侵襲和轉移[16-17]，被認為是評估宮頸癌預后的重要分子。研究[18-20]顯示，缺氧可促進乳腺癌細胞和膀胱癌細胞分泌MMPs。本研究發現TSLP可以促進HeLa、CaSki細胞分泌MMP-2、MMP-9和IL-8，提示缺氧及TSLP可通過調節這些侵襲相關分子的表達來促進宮頸癌的體外侵襲，但具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究發現缺氧可在體外通過促進宮頸癌細胞分泌TSLP，刺激MMP-2、MMP-9和IL-8產生，進一步增強宮頸癌細胞的侵襲力，促進宮頸癌的侵襲和轉移。結果提示TSLP可能與宮頸癌體內侵襲轉移密切相關，是宮頸癌靶向治療潛在的藥物靶點，值得進一步研究。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Hypoxia promotes the invasion of cervical cancer cellsinvitroby stimulating secretion of TSLP

CHANG Kai-kai, YANG Hui-li, ZHOU Wen-jie, LI Ming-qing, XIE Feng*

Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital & Institute of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, Shanghai 200011, China

Objective： To explore the effects of hypoxia and thymic stromal lymphopoietin (TSLP) on the invasion of cervical cancer cellsinvitro. Methods： Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to analyze the effects of normoxia and hypoxia on the secretion level of TSLP, and to analyze the effects of recombinant human TSLP (rhTSLP) protein on the expression levels of matrix metalloprotein-2 (MMP-2), MMP-9， and IL-8 in cervical cancer cell lines HeLa and CaSki. Matrigel invasion assay was used to investigate the effects of rhTSLP, hypoxia, and anti-human TSLP (aTSLP) neutralizing antibody on the invasiveness of HeLa and CaSki cellsinvitro. Results： Under hypoxia exposure, the levels of TSLP secretion in HeLa and CaSki cells were significantly increased (P<0.01). RhTSLP (100 ng/mL) stimulationinvitrosignificantly enhanced the invasiveness of HeLa and CaSki cells (P<0.001), and promoted the productions of MMP-2, MMP-9， and IL-8 (P<0.01). The invasiveness of HeLa and CaSki cells can be promoted significantly under hypoxia exposure (P<0.001). In contrast, aTSLP (5 μg/mL) inhibited the invasiveness of HeLa and CaSki cells (P<0.05), and partly inhibited the stimulatory effect of hypoxia on invasiveness of HeLa and CaSki cells (P<0.05). Conclusions： Hypoxia facilitates the invasion of cervical cancer cellsinvitroby up-regulating the secretion of TSLP.

thymic stromal lymphopoietin; hypoxia; cervical cancer; invasion

2017-02-14 [接受日期] 2017-02-24

國家自然科學基金(81302260)，上海市自然科學基金(17ZR1403200). Supported by National Natural Science Foundation of China (81302260) and Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1403200).

常凱凱，博士，住院醫師. E-mail: cc405@126.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-33189900, E-mail: ylxiefeng@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170114

R 737.33

A