基于改進的DNA連接酶鏈式反應發現NOD2基因多態性與冠心病的相關性

李揚，楊熹，田小利

基于改進的DNA連接酶鏈式反應發現NOD2基因多態性與冠心病的相關性

李揚，楊熹，田小利

目的：本研究改進基于脫氧核糖核酸（DNA）連接酶的中低通量基因分型方法，并用此方法進行核苷酸結合寡聚結構域（NOD）樣受體基因NOD1和NOD2與冠心病的關聯分析。

方法：通過多重聚合酶鏈式反應（PCR）預擴增增加連接模板分子數量，提高特異性連接效率，優化DNA探針設計，摸索連接反應溫度、時間、循環圈數及連接酶種類實現等位基因特異性連接，通過熒光摻入PCR和毛細管電泳實現多種等位基因特異性產物一次性檢測。Sanger測序驗證此方法準確性后，利用此方法對NOD1和NOD2基因上的單核苷酸多態性（SNP）位點在1 555例冠心病患者和1887例對照受試者中進行分型和關聯分析。

結果：通過優化反應條件和等位基因特異性探針設計原則，實現10 ng DNA樣本一次性分型30個等位基因多態性位點?；诟倪M的DNA連接酶中低通量基因分型方法，NOD1、NOD2基因與冠心病的關聯分析發現，NOD2基因上rs1861759和rs751271位點在非高血壓條件下與冠心病相關（P均＜0.05），經Bonferroni多重檢驗校正后，相關性仍然顯著（P均＜0.05）。

結論：本研究優化了DNA連接酶鏈式反應技術在設計上的關鍵點，聯合使用多重PCR和毛細管電泳，建立了一種高準確性、低成本、滿足基于中低通量位點分型的臨床分子診斷和科研需求的基因分型新方法，并用該方法發現NOD2基因上的位點rs1861759和rs751271在非高血壓條件下與冠心病相關。

冠狀動脈疾??；基因分型；DNA連接酶類；多態性，單核苷酸

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:569.)

隨著精準醫療理念的推廣，基因分型在臨床診斷、個體化用藥指導等方面的應用需求與日劇增[1]?；蚍中头椒ㄐ杓骖櫲肆Α⑽锪皶r間成本，同時需要一個合適的通量符合對應的要求。常見的單一位點基因檢測手段有Sanger測序、限制性片段長度多態性[2]、單鏈構象多態性分析[3]、等位基因特異性聚合酶鏈式反應（PCR）[4]、TaqMan[5]、連接酶檢測反應（LDR）[6]等。雖然這些方法精確度高，但如果需要檢測比較多的單核苷酸多態性（SNP）位點，速度慢，成本高。高通量基因分型的手段有二代測序、雜交芯片等，可以一次分型百萬或更多的位點，但涉及復雜的生物信息學分析，得到較多冗余信息，成本昂貴[7,8]。如果需要分型的位點達不到如此通量，高通量基因分型手段也不是很好的選擇。本研究擬建立一種基于脫氧核糖核酸（DNA）連接酶的基因分型新方法，可高準確性、低成本、快速分型十幾個甚至幾十個位點，滿足基于中低通量位點分型進行的臨床分子診斷和科研需求。

模式識別受體是一類能特異識別病原微生物的某些結構、進化上保守的分子，其募集接頭蛋白并激活下游的相關信號通路，從而啟動機體的免疫應答，在宿主的先天性免疫中發揮著重要作用。目前已報道的模式識別受體主要包括Toll 樣受體、核苷酸結合寡聚結構域（NOD）樣受體、維甲酸誘導基因（RIG）樣受體等[9]。炎癥和先天性免疫在動脈粥樣硬化病理過程中起非常重要的作用，Toll樣模式識別受體與動脈粥樣硬化性疾病如冠心病的密切關系已經逐漸被大家所認識[10,11]。與Toll樣受體不同，NOD樣受體主要識別細胞內的細菌產物。目前，NOD樣受體與冠心病的關系還不清楚。NOD樣受體家族中，NOD1和NOD2是最早被發現的兩類分子。NOD1在多種細胞中表達，而NOD2主要表達在巨噬細胞和樹突狀細胞[12]。本研究將利用建立的基因分型新方法進行NOD1和NOD2與冠心病的關聯分析。

表1 基因位點rs1861759和rs751271預擴增引物和探針序列

1 材料與方法

1.1 通用試劑

EasyTaq DNA聚合酶及緩沖液購自北京全式金生物公司；10 mmol dNTP購自賽百盛生物公司；DNA marker購自博邁德生物公司；T4多聚核苷酸激酶及緩沖液購自NEB公司；Taq DNA連接酶及緩沖液購自NEB公司；pIRES-neo質粒購自Clontech公司；Hi-Di甲酰胺等片段分析試劑購自Life Technologies公司。

1.2 DNA探針及引物

DNA 探針和引物（包括熒光修飾引物）由賽百盛生物公司合成，用于擴增的通用引物序列是：T7m: GGATACGACTCACTATAGGT；M13m: GGTAAGGACGACGGTCCAGT；M13Rm: GCGGATAACAAGTTCACACT。位點rs1861759和rs751271預擴增引物和探針序列見表1。

1.3 冠心病患者和對照受試者

本研究中，1 555例冠心病患者資料來自解放軍總醫院心內科，冠心病、高血壓及糖尿病的診斷標準如之前已發表文章所述[13]，1 887例對照受試者資料來自北京大學體檢中心。

1.4 多重PCR預擴增

預擴增引物設計使待檢測位點位于產物中部，每對引物單獨使用時，10 ng基因組模板DNA進行35圈擴增有明顯目的條帶，允許有少量非特異擴增。20 μl多重PCR體系使用1 μl引物混合物（5 μmol/引物）進行第一輪擴增。

1.5 用于連接酶鏈式反應（LCR）的DNA探針設計

如圖1所示，每個SNP位點需要6條DNA探針進行LCR反應。其中，rsX-A、rsX-G、rsX-NC和rsX-NT為等位基因特異性探針，其5’或3’末端為特定等位基因。rsX-N、rsX-NC、rsX-NT序列與基因組匹配。rsX-A和rsX-G包括與基因組序列匹配的部分（黑色線）和與通用引物T7m[6-羧基熒光素（FAM）藍色熒光標記]或M13Rm[5-六氯熒光素（HEX）綠色熒光標記]結合序列（藍色線），其中一個等位基因的特異探針還有3個與基因組不互補的堿基（黃色線）以控制兩個等位基因的終產物有3個堿基的長度差異。rsX包括與基因組序列匹配的部分（黑色線）和與質粒模板結合的序列（粉紅色）。質粒序列將用于擴增產生含有stuffer序列和M13m（通用引物）結合序列的長探針，同時該序列決定stuffer序列的長度，從而控制該位點擴增終產物的大小。

1.6 DNA探針預處理和多重LCR

設計合成的rsX-N、rsX-A、rsX-G不需要處理，rs-NC和rsNT需要磷酸化處理，rsX需要磷酸化之后通過PCR產生長度90～250 bp的DNA單鏈探針。磷酸化使用T4多聚核苷酸激酶，DNA長探針制備為不對稱PCR（引物M13m和磷酸化的rsX比例1:20）。

對探針進行預混合：（1）LA，未磷酸化組：rsX-A、rsX-G和rsX-N，每個終濃度為1 μmol；（2）LB，磷酸化組：Pi-rsX-NC和Pi-rsX-NT，終濃度1 μmol；（3）LC：長度特異性序列等體積混合。Taq DNA連接酶催化的多重LCR體系包括：LA，0.2 μl；LB，0.2 μl；LC，1 μl。反應條件為94℃，20 s；48℃，150 s；循環35圈；4℃結束反應。

1.7 熒光摻入PCR

熒光引物（M13Rm-HEX／T7m-FAM）

和通用引物M13m的PCR擴增體系10 μl，

包含10倍稀釋的連接產物1 μl。反應條件：

55℃退火，30 s；72℃延伸，30 s；循環25圈。

1.8 片段分析

HiDi甲酰胺與Liz 500以60:1比例混合，

9 μl混合液加1 μl熒光摻入PCR產物，94℃變

性2 min后立刻冰置，冷卻后進行毛細管電泳。

片段分析結果使用GeneMarker V1.6分析。

1.9 電泳結果判讀

對于不確定峰型歸類的樣本均進行1

代測序驗證，若不確定樣本超過5%則該位點視為分型失??；成功判定的樣本，也按一定的比例抽樣進行1代測序驗證，若準確率低則該位點也被視為分型失敗。

1.10 統計學方法

利用SPSS軟件中二分類Logistic回歸分析每個SNP位點在危險因素校正和不校正情況下與冠心病的相關性。多重檢驗校正采用Bonferroni校正方法。P＜0.05視為有統計學意義。

圖1 基因分型流程圖

2 結果

2.1 總體基因分型流程（圖1）

該方法分為四步：（1）基因組DNA預擴增，使包含待分型位點的基因組區域得以富集；（2）等位基因特異性連接反應，只有與模板完全匹配的探針可以高效完成連接反應；（3）熒光摻入PCR，通過熒光標記的通用引物往連接產物中摻入熒光，同時擴增富集連接產物；（4）產物通過毛細管電泳進行片段分析，同一位點的不同等位基因有3個堿基（黃色標記）的差異可以被毛細管電泳分辨，不同位點設計不同的填充序列長度（建議差異大于10 bp），也可被分辨?？紤]到毛細管電泳的分辨率和電泳效果，終產物最好100 ～250 bp。因此，單色熒光可一次分型約15個位點，設置兩種熒光不相互干擾的通用引物可使通量加倍。

2.2 預擴增PCR

比較理想的多重引物預擴增結果在100～200 bp之間有一條較粗的明亮條帶。

2.3 連接酶反應系統優化

DNA連接酶的選擇：常見的耐熱DNA連接酶有Taq DNA連接酶以及9N DNA連接酶，通過比較我們選擇了特異性更好的Taq DNA連接酶。值得注意的是，Taq DNA連接酶緩沖液含有氧化型輔酶I，長期保存必須放在-80℃，而短期保存必須放在-20℃。LCR探針設計優化：rsX和rsX-N探針無特異性問題，和模板配對的部分一般為19 bp。其他四條探針涉及到特異性配對的問題，需要符合以下條件：（1）SNP位點本身在序列一端；（2）GC含量適當，長度在11～15個堿基，3GC+AT=24-27（不包括SNP位點本身）；（3）避免簡單重復序列；（4）選擇SNP兩翼的序列中更接近上述條件的做等位基因特異性探針。LCR溫度方面，經過對比，我們發現48℃特異性最強，而且SNP之間的信號更加均一。

2.4 熒光染料的選取

熒光引物PCR中，我們嘗試了FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX多種熒光染料修飾引物。綜合考慮光譜兼容性以及引物修飾難度，最終選擇FAM和HEX兩種熒光修飾公共引物。

2.5 片段分析

熒光摻入PCR的產物因有熒光標記需要避光保存并盡快上機，上機前終產物電泳結果在150～250 bp長度范圍內可見連續條帶。上機毛細管電泳結果如圖2所示，每一個峰代表一種終產物。

2.6 NOD1和NOD2基因關聯分析

我們用該方法對NOD1和NOD2基因上的8個SNP位點（NOD1基因位點包括rs41524946、rs2284358、rs17159048、rs1558068；NOD2基因位點包括rs2111235、rs8057341、rs1861759、rs751271）在兩個人群中進行了分型，人群1包括784例冠心病患者和895例對照受試者；人群2包括474例冠心病患者和486例對照受試者（表2）。

圖2 毛細管電泳結果

表2 進行NOD1和NOD2基因分型的兩個人群的基本資料比較

8個位點中，rs1558068位點因峰形圖不確定歸類的樣本超過5%被視為分型失敗，其余7個位點可以成功分型，每個位點抽檢32個樣本進行1代測序驗證結果吻合率達到100%，認為分型結果準確可靠（圖3）。

圖3 NOD的7個SNP位點三種基因型的分型電泳圖舉例

與冠心病關聯分析的結果顯示，7個位點等位基因分布頻率在冠心病患者和對照受試者中無明顯區別，說明NOD1和NOD2基因與冠心病發病不相關。當以性別進行分層分析時，NOD2基因的兩個位點rs8057341和rs751271在女性中顯示出與冠心病一定的相關性，合并兩個人群后，非校正P值達到0.002和0.003，但經過危險因素校正后并不相關。當以是否合并高血壓進行分層分析時，結果顯示，在合并高血壓的人群，7個位點與冠心病無明顯相關性。但在非高血壓人群，NOD2基因的4個位點都顯示出一致的相關性（表3）。

合并兩個人群并進行危險因素校正后，其中的兩個位點rs1861759和rs751271的P值達到0.001和0.002，經過多重檢驗Bonferroni校正后P值分別為0.007和0.014，仍然有統計學意義。另外兩個位點在合并人群中P值達到0.015和0.011，但經多重檢驗Bonferroni校正后沒有統計學意義。我們計算了rs1861759和rs751271位點的統計檢驗效能，如果設置檢驗閾值（α）為0.05，兩位點的檢驗效能分別為0.944和0.766。

為了進一步提高檢驗效能，得到更加可靠的結論，我們在另一個非高血壓人群（人群3）中用直接測序的方法檢測了目標位點rs1861759和rs751271，并進行與冠心病的關聯分析（表4）。結果發現，兩位點在非高血壓人群中仍然顯示與冠心病相關（表5）。三個人群合并后，設置α為0.05，計算兩個位點的統計效能分別為0.998和0.917；如果考慮多重檢驗，以最嚴格的Bonferroni方法計算，設置α= 0.05/7，計算兩個位點的統計效能分別為0.981和0.760。

表4 非高血壓人群（人群3）的基本資料（n=803）

表3 候選基因位點與不合并高血壓的冠心病的關聯分析

表5 基因位點rs1861759和rs751271與不合并高血壓的冠心病關聯分析

3 討論

本研究優化了DNA連接酶鏈式反應技術在設計上的關鍵點，聯合使用多重PCR和毛細管電泳，建立了一種基于DNA連接酶鏈式反應的中低通量基因分型新方法，填補了中低通量位點分型缺乏準確、快速而又低成本方法的空缺。方法創新點在于：（1）在探針上加入人工特異片段控制產物長度和擴增的特異性，實現多個位點的分型在同一個反應中進行；（2）確定等位基因特異性探針設計原則，增加連接反應特異性，進而提高分型準確性；（3） 摻入熒光引物，借助高分辨率毛細管凝膠電泳，實現多個位點一次性檢測，增加通量。4）與多重PCR結合，降低模板DNA用量。

由于實驗中每個位點涉及多種DNA探針，探針制備成本較高，步驟較多。因此，本方法對應于中低通量位點、大樣本量的分型需求，這樣分型條件一旦確定可以分型大量樣本，平均到每個樣本的分型成本和工作量較低。除了經濟成本低，本方法的樣本成本也很低。通常一代測序每個位點需要至少10 ng的模板DNA，而本方法平均每個位點僅用低于1 ng的模板DNA。第三，本方法快速而準確性高，從預擴增到拿到結果1天內完成，且準確性與一代測序相當。

由結果可見，同一批電泳的不同位點的峰型圖高低并不完全一致，同一位點的兩個等位基因的高度也不一致，這是由于多步反應中不同位點或同一位點的兩個等位基因反應效率差異導致的。如果位點間差異過大，甚至有的位點沒有出峰，可以調整預擴增反應引物的濃度來平衡不同位點產物量。對于同一位點兩個等位基因高度差異問題，只要分型結果中有明確的3種類型的峰型圖，可以準確判定3種基因型，即可不必調整，否則需要調整LCR過程中探針的用量。不同位點3種基因型的峰型圖是有差異的，所以每做新位點時需要首先通過一代測序明確3種基因型的峰圖形式。

越來越多的研究揭示，細菌感染在動脈粥樣硬化發病機制中的重要作用[14-16]。因此，細胞內識別細菌產物的NOD樣受體有可能與冠心病的發生相關。應用新的分型方法，我們對NOD樣受體NOD1和NOD2基因進行了與冠心病的關聯分析。在非高血壓人群，NOD2基因的兩個位點rs1861759和rs751271與冠心病相關。然而，在本研究中，我們并沒有發現NOD1基因的多態性位點與冠心病的相關性。NOD1在多種細胞中表達，而NOD2主要表達在巨噬細胞和樹突狀細胞[12]；此前的研究也發現NOD1和 NOD2兩基因的表達調控模式不盡相同[17]，暗示這兩個基因在動脈粥樣硬化病理過程中作用可能不同。當然，由于我們的樣本數量是有限的，本研究并不能排除NOD1基因與冠心病的相關性。

綜上所述，本研究建立了一種基于DNA連接酶的基因分型新方法，該方法準確、快速而又低成本，適用于一般實驗條件下中低通量位點、大樣本量的分型需求。應用該新方法，我們完成了NOD樣受體基因NOD1和NOD2與冠心病的關聯分析，發現NOD2基因上位點rs1861759和rs751271在非高血壓條件下與冠心病相關。

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Association Study of NOD2 Gene and Coronary Artery Disease Based on Optimized DNA Ligase Chain Reaction

LI Yang, YANG Xi, TIAN Xiao-li.
Vascular Biology Laboratory, Beijing Anzhen Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing Institute of Heart, Lung and Blood Vessel Diseases, Beijing (100029), China

TIAN Xiao-li, Email: tianxiaoli@ncu.edu.cn

Objective: Based on optimized method of DNA ligase chain reaction in medium/low throughput genotyping, we assessed the relationship between NOD-like receptor genes NOD1, NOD2 and coronary artery disease (CAD) occurrence.

Methods: A multiplex PCR was conducted to enrich DNA template; probe design, annealing temperature, time and number of circulation of PCR were opfimizecl for allele specific ligation; allele specific products were identified by fluorescence PCR and capillary electrophoresis; the accuracy was verified by Sanger sequencing. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) on NOD1 gene and NOD2 gene were examined in 1555 CAD patients and 1887 control subjects; the relationship between SNPs and CAD occurrence was studied.

Results: Based on optimized PCR condition and allele specific probe design, 30 allele loci genotyping can be genotyped by 10ng DNA template at one time. Association study presented that rs751271 and rs1861759 on NOD2 gene were related to non-hypertensive CAD, all P＜0.05; with Bonferroni correction, such correlation was still significant, all P＜0.05.

Conclusion: We optimized DNA ligase chain reaction and established a novel high accuracy, low cost method for thedemand of medium/low throughput genotyping in clinical molecular diagnosis. With this method, we identified that rs1861759 and rs751271 on NOD2 gene were associated with non-hypertensive CAD.

Coronary atery disease; Genotype; DNA ligases; Polymorphism, mononucleotide

2017-01-17）

（編輯：朱柳媛）

973項目（2013CB530700）；國家自然科學基金重點項目（81130003）；國家自然科學基金面上項目（81070262）

100029 北京市，首都醫科大學附屬北京安貞醫院 北京市心肺血管疾病研究所 血管生物研究室（李揚）；北京大學分子醫學研究所（楊熹）；南昌大學人類衰老研究所 生命科學學院（田小利）

李揚 助理研究員 博士 研究方向：心血管疾病遺傳學研究 Email: liyanganzhen@126.com 通訊作者：田小利 Email: tianxiaoli@ncu.edu.cn中圖分類號：R54 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3614（2017）06-0569-06 doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2017.06.010