LncRNA-MIAT在腫瘤壞死因子α介導的血管內皮細胞炎癥中的表達及作用

任成龍，張璐，寧險峰，趙青，蔡尚郎，張文忠

基礎與實驗研究

LncRNA-MIAT在腫瘤壞死因子α介導的血管內皮細胞炎癥中的表達及作用

任成龍，張璐*，寧險峰，趙青，蔡尚郎，張文忠

目的：體外觀察血管內皮細胞（ECs）在腫瘤壞死因子α（TNF-α）刺激下，細胞內長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）心肌梗死相關轉錄本（LncRNA-MIAT）的表達變化，并探討LncRNA-MIAT對ECs炎癥的調控作用。

方法：以TNF-α誘導ECs表達LncRNA-MIAT,采用蛋白質免疫印跡法（Western Blot）、聚合酶鏈反應（PCR）及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分別檢測ECs炎癥狀態下細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和LncRNA-MIAT的表達情況。應用MIAT小干擾核糖核酸（siRNAMIAT）轉染ECs細胞,觀察LncRNA-MIAT敲低對ICAM-1表達的影響。

結果：LncRNA-MIAT隨著TNF-α刺激時間的延長與濃度的增高呈上升趨勢,刺激24 h、48 h分別與刺激0 h、6 h、12 h比較，LncRNA-MIAT表達量均增多，差異均具有統計學意義（P＜0.05）； TNF-α刺激濃度為1.000 ng/ml、10.000 ng/ml分別與刺激濃度為0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比較，LncRNA-MIAT表達量增多，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。 ECs經siRNAMIAT轉染后，TNF-α誘導的ICAM-1蛋白表達被顯著抑制（P＜0.05）。

結論：LncRNA-MIAT可能參與血管ECs的炎癥反應，并可能起到促炎作用。

核糖核酸酶類；腫瘤壞死因子α；細胞間黏附分子-1

冠心病的發生率和致死率呈逐漸上升趨勢，成為威脅人們健康與生命的重要慢性疾病和耗費國家巨額財政的主要病種之一。動脈粥樣硬化是冠心病的主要病理基礎，其起始于血管內皮細胞（ECs）的損傷，損傷后的ECs會分泌細胞因子誘導單核細胞遷入內膜，吞噬脂質形成泡沫細胞，即在粥樣硬化斑塊內出現的特征性細胞，因此ECs在動脈粥樣硬化過程中起到了關鍵作用[1]。全基因關聯性研究（GWAS）發現，哺乳動物基因中超過98%轉錄為非編碼核糖核酸（ncRNA），只有不到2%的基因轉錄蛋白質[2]。而隨后的研究發現，長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA） 屬于ncRNA的重要組成部分，其是指長度 ＞ 200 nt、無蛋白編碼功能的RNA，可從表觀遺傳學、轉錄調控及轉錄后調控等多個層面實現對基因表達的調控[3]，其表達水平的變化與多種疾病密切相關，亦影響到心血管疾病[4，5]。研究發現，LncRNA-心肌梗死相關轉錄本（MIAT）在血管動脈粥樣硬化進程中起調控作用[6]。

腫瘤壞死因子α（TNF-α）是目前公認在血管粥樣硬化中重要的致炎因子之一[7]。我們應用TNF-α誘導ECs炎癥狀態，觀察ECs炎癥狀態下細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和LncRNA-MIAT的表達情況，后采用siRNAMIAT敲低ECs細胞中LncRNA-MIAT，進一步觀察TNF-α刺激下敲低LncRNA-MIAT后的ECs中ICAM-1的表達情況，旨在探討LncRNA-MIAT在ECs炎癥中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

人血管ECs株購自中國科學院上海細胞庫，用含體積分數10%新生胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，以質量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 試劑

DMEM高糖培養基購于美國Solarbio公司，胎牛血清購自上海依科賽生物科技有限公司，TNF-α購自美國PeproTech公司，ICAM-1抗體購自英國Abcam公司，總RNA抽提試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，熒光定量試劑Premix Taq、逆轉錄試劑盒SYBR Green II購自日本TAKARA公司，小干擾核糖核酸（siRNA）（siRNAScramble、siRNAMIAT）購自上海吉瑪制藥技術有限公司，轉染試劑Hiperfect購自德國Qiagen公司，RIPA蛋白裂解液購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 研究方法

細胞培養方法：（1）常規培養: ECs采用含體積分數10%胎牛血清、1 %雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM 高糖培養基，在37℃、常氧CO2培養箱中培養。（2） TNF-α刺激ECs培養： ①時間刺激：按照六孔細胞培養板中細胞密度于加藥日達到50 %～60 %密度鋪板，以TNF-α濃度為1.000 ng/ml的細胞培養液培養細胞，分別刺激0 h、6 h、12 h、24 h和48 h后收集細胞。 ②計量刺激：按照六孔細胞培養板中細胞密度于加藥日達50 %～60 %密度鋪板，分別以TNF-α濃度為0.000 ng/ml、0.125 ng/ml、0.250 ng/ ml、0.500 ng/ml、1.000 ng/m和l0.000 ng/ml的細胞培養液培養細胞24 h，于24 h后收集細胞。 ③常規TNF-α刺激：以TNF-α濃度為1.000 ng/ml的細胞培養液設定時間培養細胞。

聚合酶鏈反應（PCR）：檢測常規培養下ECs中LncRNA-MIAT表達，從NCBI數據庫 （http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站獲得LncRNA-MIAT序列，以Primier 5.0軟件設計引物，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成LncRNA-MIAT正義鏈:5'-GAGATTGGCGATGGTTGTGA-3'，反義鏈: 5'-CAGTGACGCTCCTTTGTTGAA-3'，以Trizol提取細胞總RNA，合成互補脫氧核糖核酸（cDNA）。PCR擴增LncRNA-MIAT，以空白組作為內部參照。配制20 μl反應體系。PCR反應條件: 95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線下顯影拍照，根據條帶位置確定是否表達。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：按Trizol試劑盒說明書提取ECs總RNA，測得RNA濃度，質量定為500 ng，求得逆轉錄體積后，根據逆轉錄試劑盒說明書將已經提取的RNA逆轉錄成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒配置20 μl反應體系（SYBRII 10 μl、cDNA 2 μl、上游引物 0.4 μl、下游引物 0.4μl、超純水 8.0 μl）。以β肌動蛋白（β-actin）作為內部參照，反應條件如下：95℃預變性30 s：之后95℃ 5 s，60℃ 30 s，進行40個循環復性；最后94℃90 s，60℃ 180 s延伸，繪制擴增曲線。引物序列：正義鏈:5'-GAGATTGGCGATGGTTGTGA-3'，反義鏈:5'-CAGTGACGCTCCTTTGTTGAA-3'。

siRNA干擾：按照12孔細胞培養板中細胞密度于轉染日達30%～40%密度鋪板，根據轉染試劑Hiperfect說明書，轉染前將孔板內細胞換液，每孔加入900 μl正常培養液。100 μl轉染體系： 6 μl Hiperfect、2 μl siRNA，DMEM補齊至100 μl，常溫孵育10 min后，加入12孔板，即每孔1 000μl（6孔板轉染時siRNA、Hiperfect加倍）。應用siRNAScramble作為siRNAMIAT的陰性對照，分別于轉染后培養24 h、48 h，收細胞進行qRT-PCR，檢測轉染效果。

蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測ICAM-1的表達：收集細胞，RIPA蛋白裂解液提取各組細胞中的總蛋白，BCA法定量蛋白，于10 %的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，濕法轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上.以體積分數5%的脫脂奶粉封閉后，加入ICAM-1抗體，4 ℃孵育過夜，緩沖溶液（TBST）漂洗后加入二抗，化學發光法顯色，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，用目的蛋白ICAM-1的灰度值/內參照灰度值的比值，作為ICAM-1的相對表達量。

統計學處理：采用Image J、Prism5.0軟件進行統計分析，統計結果以均數±標準誤（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR結果

PCR擴增產物見圖1，與空白對照a相比，加入MIAT引物的b、c條帶明顯，提示ECs中表達LncRNA-MIAT，b與c條帶亮度的比較差異不明顯，說明當引物濃度增加時，LncRNA-MIAT表達量增加不明顯。

圖1 聚合酶鏈反應電泳結果

2.2 TNF-α不同時間與不同濃度刺激ECs后LncRNA-MIAT表達結果（圖2）

隨著TNF-α刺激時間延長，LncRNA-MIAT表達呈逐漸上升趨勢。刺激24 h與0 h、6 h、12 h比較，LncRNA-MIAT表達量增多，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）；刺激48 h與0 h、6 h、12 h比較，LncRNA-MIAT表達量增多，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。圖2A

隨著TNF-α刺激濃度增高，LncRNA-MIAT表達呈逐漸上升趨勢。TNF-α刺激濃度1.000 ng/ml與刺激濃度0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比較，LncRNA-MIAT表達量均增多，差異具有統計學意義（P均＜0.05）； TNF-α刺激濃度10.000 ng/ml與刺激濃度0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比較，LncRNAMIAT表達量均增多，差異具有統計學意義（P均＜0.05）。圖2B

圖2 TNF-α不同時間不同濃度刺激后LncRNA-MIAT的表達結果

2.3 qRT-PCR檢測siRNAMIAT轉染ECs后LncRNA-MIAT表達結果 （圖3）

siRNAMIAT轉染后培養 48 h與siRNAScramble比較，LncRNA-MIAT表達量顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；siRNAMIAT 轉染后培養48 h與siRNAMIAT 24 h相比，LncRNA-MIAT表達量下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 Western Blot檢測ICAM-1結果（圖4）

應用濃度為1.000 ng/ml 的TNF-α刺激ECs后，ICAM-1的表達與空白對照（不加TNF-α）相比顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4A）。應用siRNAMIAT轉染ECs培養48 h后，應用濃度為1.000 ng/ml TNF-α刺激ECs后，與陽性對照（加1.000 ng/ml TNF-α刺激而未經siRNAMIAT轉染）相比，ICAM-1表達量被明顯抑制，差異有統計學意義（P＜0.01）；與空白對照相比，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。圖4B

圖3 siRNAMIAT轉染ECs后LncRNA-MIAT的表達結果

圖4 蛋白質免疫印跡法檢測ICAM-1的表達結果

3 討論

近年來，由于LncRNA在人類疾病的多種作用而獲得廣泛關注[8]。相對于編碼蛋白質的基因，LncRNA的表達量不高，但是由于它們在生物過程和人類疾病中所起的重要作用而受到生物學家和臨床醫生的關注[4]。LncRNA的保守性相較于編碼蛋白質的RNA較差，但在其分子內部，卻含有較為保守的序列或二級結構，且其表達具有時空特異性，這些現象都提示LncRNA具有重要的生理生化功能。有些LncRNA和信使RNA（mRNA）一樣具有5'帽子結構和 PolyA尾結構，通過剪切加工而成熟。在大多數情況下，LncRNA通過不同的作用機制參與表遺傳學的調控、轉錄和轉錄后調控。同時，LncRNA還可作為小RNA的前體和亞細胞結構的組織框架。特定的LncRNA發生結構突變，引起表達水平及定位的改變，已被證明參與許多疾病的發生發展。本研究中，我們提供了直接證據，LncRNAMIAT參與調節ECs功能和病理變化。

目前，已經發現多種LncRNA參與心血管疾病的發生發展。LncRNA-Bvht可以通過作為心血管調節基因網絡中的核心基因調節心血管病的進程[9]。LncRNA-Fendrr通過調節染色質修飾，從而影響心血管系統的發育[10]。血管ECs存在大量LncRNAMalat1，其參與調節一些血管內皮功能，例如細胞遷移和血管側枝形成[11]。此外一些LncRNA已被證明與血管緊張素II相關性疾病有相關性，這些疾病其中包括冠脈粥樣硬化[12]。

血管粥樣硬化是心血管疾病的主要病理基礎，其起始于ECs的損傷[13]，而TNF-α是目前公認的致炎因子之一[14]，同樣，蛋白ICAM-1也被認為是提示炎癥的主要目的蛋白之一[15]。自LncRNAMIAT被發現后，隨后的一系列研究發現MIAT通過某些機制參與微血管功能失調的過程[16]，而微血管功能失調恰恰是動脈粥樣硬化過程中至關重要的因素。此外有研究發現，在神經系統中，LncRNA-神經生長（LncRNA-ND）促進神經祖細胞的分化，并在神經細胞分化過程中起到調節作用[17]，而當LncRNA-ND功能失調時可以導致神經細胞功能障礙，甚至影響細胞正常生存[16]。在內分泌系統中，LncRNA-MIAT也參與糖尿病性視網膜病變的病理進程[6，18]。應用siRNA敲低LncRNA-MIAT后，可降低大鼠ECs凋亡、血管通透性增加和減少糖尿病誘導產生的促炎蛋白，從而減輕視網膜血管損傷[6]。

因此本研究首先通過TNF-α對ECs的刺激模擬動脈粥樣硬化ECs的炎癥損傷，通過Wstern Blot檢測確定ICAM-1的表達增加。通過qRTPCR檢測ECs中LncRNA-MIAT的表達，結果證實ECs中能夠表達LncRNA-MIAT。之后，我們研究了LncRNA-MIAT在TNF-α誘導的血管ECs炎癥中的表達及調控作用。結果顯示，對于致炎因子TNF-α的刺激，ECs中LncRNA-MIAT的表達是增加的，隨著TNF-α的刺激時間延長，LncRNAMIAT的表達趨勢是逐漸上升的，而隨TNF-α的刺激濃度的升高，LncRNA-MIAT的表達趨勢也是逐漸上升的。我們又通過siRNA MIAT敲低LncRNAMIAT來檢測ECs中ICAM-1的表達量的變化，發現LncRNA-MIAT敲低后，ICAM-1的表達量較對照明顯減少。實驗結果提示，LncRNA-MIAT可能參與ECs的炎癥進程，并對ECs有促炎作用。

目前，對于LncRNA-MIAT的研究主要集中在神經系統、內分泌系統和心血管系統[4]，但研究尚不透徹。而對于LncRNA-MIAT在其他系統中的作用以及其在神經系統、內分泌系統和心血管系統中的研究成果與其它系統相關性尚不明確，因此，尚需要深入細致的研究。本研究結果表明LncRNAMIAT可能參與ECs的炎癥反應，豐富了關于LncRNA的研究，并提示LncRNA-MIAT在動脈粥樣硬化相關疾病的治療方面具有潛在的應用價值。

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Expression and Effect of LncRNA-MIAT in Tumor Necrosis Factor-α Induced Endothelial Cell Inflammation

REN Cheng-long, ZHANG Lu, NING Xian-feng, ZHAO Qing, CAI Shang-lang, ZHANG Wen-zhong.
Department of Cardiology, Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao (266003), Shandong, China

NING Xian-feng, Email: nxf66@163.com

Objective: To observe the expression of long non-coding RNA myocardial infarction associated transcript (LncRNAMIAT) in tumor necrosis factor-α (TNF-α) induced endothelial cells (ECs) inflammation in vitro and to study the impact of LncRNA-MIAT on inflammatory regulation.

Methods: LncRNA-MIAT expression in ECs was induced by TNF-α at different time and concentration. Expressions of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and LncRNA-MIAT in inflammatory ECs were examined by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot analysis. Moreover, ECs was transfected by siRNAMIAT to observe the effect of LncRNA-MIAT knock-down on ICAM-1 expression.

Results: LncRNA-MIAT expression showed the increasing trend by elevated time and concentration of TNF-stimulation. Compared with TNF-α stimulation at 0h, 6h and 12h, LncRNA-MIAT expressions were increased at 24h and 48h of TNF-α stimulation respectively, all P＜0.05; compared with TNF-α concentration at 0ng/ml and 0.125ng/ml, LncRNA-MIAT expressions were elevated by TNF-α stimulation at 1.000ng/ml and 10.000ng/ml respectively, all P＜0.05. With siRNAMIAT knock-down, TNF-α induced ICAM-1 protein expression was significantly reduced in ECs, P＜0.05.

Conclusion: LncRNA-MIAT might be involved in ECs inflammatory response and it may play a role to promote inflammation.

Ribonucleases; Tumor necrosis factor alpha; Cell adhesion molecule-1 (Chinese Circulation Journal, 2017,32:607.)

2016-09-26）

（編輯：常文靜）

山東省自然科學基金培養基金項目（ZR2014HP017）

266003 山東省青島市，青島大學附屬醫院 心內科（任成龍、寧險峰、趙青、蔡尚郎、張文忠），中心實驗室（張璐）

任成龍 碩士研究生 主要研究方向:冠心病的診斷與治療 Email：17614494@qq.com 通訊作者：寧險峰 Email：nxf66@163.com*為共同第一作者

R54

A

1000-3614（2017）06-0607-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.06.018