不同端粒片段通過沉默信息調節因子1/抑癌基因P53促進血管平滑肌細胞凋亡

呂娟，王紅

不同端粒片段通過沉默信息調節因子1/抑癌基因P53促進血管平滑肌細胞凋亡

呂娟，王紅

目的：研究不同端粒寡核苷酸序列對大鼠胸大動脈平滑肌細胞（A7R5） 凋亡的影響，及沉默信息調節因子1（SIRT1）/抑癌基因P53（P53）信號通路是否參與調控端粒寡核苷酸序列誘導A7R5的凋亡。

方法：將三種端粒重復序列端粒寡核苷酸序列的二聚體、四聚體、六聚體[TE-12（TTAGGG）2、TE-24（TTAGGG）4、TE-36（TTAGGG）6]轉染至A7R5，分別作為TE-12組、TE-24組、TE-36組，另設A7R5空白為陰性對照組。應用流式細胞儀檢測各端粒寡核苷酸序列轉染后A7R5的凋亡情況。采用逆轉錄多聚酶聯反應（RT-PCR）及蛋白免疫印跡（Western-blot）檢測TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組SIRT1、P53基因及蛋白水平。

結果：將TE-12、TE-24、TE-36成功轉染進A7R5，各組轉染率差異無統計學意義。TE-12組A7R5凋亡率明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組，TE-24組細胞凋亡率最低，但亦明顯高于陰性對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。TE-12組A7R5SIRT1mRNA及蛋白水平明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。TE-24組A7R5P53mRNA及蛋白水平明顯低于TE-36組、TE-12組和陰性對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

結論：端粒寡核苷酸序列促進A7R5的凋亡。不同結構的端粒寡核苷酸序列引起A7R5凋亡程度不同，在選取的三種結構中，端粒單鏈序列TE-12引起A7R5凋亡最明顯。端粒寡核苷酸序列對A7R5凋亡的作用可能與SIRT1/P53信號通路有關。

寡核苷酸類; 肌,平滑,血管; 凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:612.)

針對增齡而出現的血管老化問題已成為防治心血管疾病的新靶點[1]。血管老化作為一種退行性疾病，其病理改變主要涉及內皮細胞和平滑肌細胞的凋亡[2-4]。端粒學說是目前被認可的衰老機制之一，研究發現端粒長度縮短啟動了細胞凋亡過程，端粒可能通過細胞凋亡的形式與血管老化有密切聯系[5-6]。當端粒因分裂而縮短至臨界長度時，細胞停止分裂走向凋亡，但具體機制尚不清楚[7-10]。沉默信息調節因子1（SIRT1）為哺乳動Sirtuins家族成員之一,是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD+）的第 III 類組蛋白去乙酰化酶。SIRT1是重要的抗衰老蛋白，通過使多個蛋白質去乙酰化而改變其活性，涉及細胞內基因沉默、能量代謝、抗細胞凋亡和氧化應激等多種生物功能[11-13]。抑癌基因P53（P53）的細胞內活性作用主要體現在對細胞周期的阻滯、促進細胞凋亡和DNA修復[14]。近期研究表明，SIRT1去乙酰化酶與細胞凋亡關系密切，SIRT1還可通過將P53蛋白第382位賴氨酸殘基乙酰化，降低P53蛋白與DNA順式元件的結合能力，從而抑制細胞凋亡[15-19]。端粒是否通過SIRT1/P53通路調節平滑肌細胞的凋亡，目前尚少見報道。本實驗旨在探討不同端粒寡核苷酸序列對平滑肌細胞凋亡的影響，以及SIRT1/P53通路是否參與其中的調控。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要材料

大鼠胸大動脈平滑肌細胞（A7R5）購自上海生物科技有限公司，澳洲胎牛血清、Gene JET RNA Purification kit、Maxima SYBR Green/ROXqPCR Master Mi購自北京寶賽生物技術有限公司，端粒寡核苷酸序列（帶修飾和熒光標記）、Invitrgen-MA5-17142、DOTAP LIPosomalTranstreagen購自北京中杉金橋生物技術有限公司，P53、SIRT1一抗、二抗均為上海邁瑞爾化學技術有限公司產品。Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海華雅思創生物科技有限公司。

1.2 不同端粒寡核苷酸序列細胞的轉染

將三種端粒重復序列，端粒寡核苷酸序列的二聚體、四聚體、六聚體[TE-12（TTAGGG）2、TE-24（TTAGGG）4、TE-36（TTAGGG）6]轉染至A7R5[20-23]。轉染方法按寡核苷酸轉染試劑盒所述方法，具體步驟如下：（1）轉染前一天將A7R5種入六孔板，密度為80%，標記為TE-12組、TE-24組、TE-36組，另設A7R5空白為陰性對照組（2）轉染當天每個孔分為兩支離心管，第一支加入2.5 μg寡核苷酸片段后用無血清培養基補至25 μl，第二支加入25 μl無血清培養基和25 μl陽離子脂質體二油酰磷脂酰膽堿（DOTAP lipo）轉染試劑。將第一管核酸溶液慢慢加入第二管，輕輕混勻，室溫孵育12 min；（3）將步驟2中所得混合液加入對應孔中；（4）37℃,5% CO2培養24 h；（5）熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3 轉染不同端粒寡核苷酸序列后檢測A7R5凋亡率

采用流式細胞儀技術，使用Annexin V/ propidium iodide（PI）凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡[24-25]。按照試劑說明書，收集1×106個細胞并重懸于200 μl緩沖液，分別加入5 μl染料Annexin V和5 μl PI，室溫避光孵育15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，記錄1×104個細胞并用隨機軟件分析凋亡細胞比例。

1.4 實時定量多聚酶聯反應（qRT-PCR） 分析SIRT1信使核糖核酸（mRNA）和P53 mRNA水平

提取細胞總RNA并精制，反轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA）。在NCBI網站上進行引物設計，并交引物合成公司合成[26-27]。引物序列如下：

P53：F2-CAGCACAGGAACCTGGAACTGAGG，P53：R2-AGGTGGAAGCCATAGTTGCCTTGG，SIRT1：F2-CGGACAGTTCCAGCCATCTCTGTG，SIRT1：R2-TTGGATTCCTGCAACCTGCTCCAA，β-actin：F1-CCATCTATGAGGGTTACGCGCTCC，β-actin：R2-CACGATTTCCCTCTCAGCTGTGGT，通過設定的程序[恒溫段:50℃2 min；95℃10 min。循環段:95℃ 20 s；58℃20 s；72℃ 20 s（讀取熒光），循環段為40個循環。熔解段：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s（讀取熒光）]擴增相應的基因，用隨機系統進行數據分析，計算目的基因的循環數（Ct）值，以-ddCt作為目的基因表達水平[-ddCt=（Ct目的基因—Ct內參基因）處理組—（Ct目的基因—Ct內參基因）正常組]。所有反應獨立重復3次。

1.5 SIRT1、P53蛋白檢測

端粒寡核苷酸序列轉染細胞后于24 h收集細胞。依據試劑盒說明提取收集細胞的蛋白，并進行蛋白濃度的定量[28]。加入2倍的上樣緩沖液，沸水中煮5 min，使蛋白變性。每個上樣孔加等量蛋白，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（配制10%的分離膠和5%的濃縮膠）。將凝膠上的蛋白帶轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，4℃封閉過夜。分別加入特異性的一抗，稀釋度（抗體與封閉液的體積比）為1：800～1000，在搖床上室溫反應2～3 h后再與辣根過氧化物酶標記的二抗（1:1500）孵育1～2 h，最后用電化學（ECL）發光試劑盒發光,在暗室中進行壓片、洗片。

1.6 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析。各組數據均符合正態性，計量資料以表示。符合方差齊性檢驗數據，采用單因素方差分析。方差不齊數據，則采用兩獨立樣本秩和檢驗（Mann-Whitney U）進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同端粒寡核苷酸序列細胞轉染的情況

TE-12、TE-24、TE-36成功轉染至A7R5細胞，三組的轉染率分別是（54.42±4.98）%、（56.34±3.76）%、（58.24±2.98）%，各組轉染率差異無統計學意義（P＞0.05），不影響其凋亡率，可以進行后續試驗。圖1

圖1 熒光顯微鏡下顯示大鼠胸大動脈平滑肌細胞對熒光標記的寡核苷酸序列的攝取結果

2.2 轉染不同端粒寡核苷酸序列后檢測A7R5凋亡率

TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組的凋亡率分別是（24.52±2.14）%、（11.22±2.98）%、（17.31±3.76）%、（5.26±2.27）%。TE-12組A7R5凋亡率明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組；TE-36組A7R5凋亡率明顯高于TE-24組和陰性對照組；TE-24組A7R5凋亡率明顯高于陰性對照組；差異均有統計學意義（P均＜0.05）。圖2

2.3 各組A7R5SIRT1 mRNA及P53 mRNA水平檢測結果

各組A7R5SIRT1 mRNA水平比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5 SIRT1mRNA相對表達量分別為1.32±0.01、1.10±0.02、1.22±0.03、 0.92±0.01。TE-12組A7R5 SIRT1mRNA相對表達量明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯高于TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-24組明顯高于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統計學意義。

各組A7R5P53 mRNA水平比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5P53mRNA相對表達量分別為0.72±0.01、0.45±0.02、0.58±0.03、0.91±0.03。TE-24組A7R5 P53 mRNA相對表達量明顯低于TE-36組、TE-12組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯低于TE-12組和陰性對照組（P＜0.05）；TE-12組明顯低于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統計學意義。

圖2 各組轉染后大鼠胸大動脈平滑肌細胞凋亡率流式細胞儀檢測結果

2.4 各組A7R5 SIRT1蛋白及P53蛋白水平檢測結果

各組A7R5 SIRT1 蛋白水平比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5 SIRT1蛋白相對表達量分別為1.92±0.01、1.51±0.02、1.61±0.01、0.50±0.01。TE-12組A7R5 SIRT1蛋白相對表達量明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯高于TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-24組明顯高于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統計學意義。圖3

圖3 各組轉染后大鼠胸大動脈平滑肌細胞SIRT1蛋白水平的蛋白免疫印跡檢測結果

各組A7R5 P53蛋白水平檢測比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5 P53蛋白相對表達量分別為1.21±0.01、0.73±0.01、0.92±0.03、1.51±0.02。TE-24組A7R5 P53蛋白相對表達量明顯低于TE-36組、TE-12組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯低于TE-12組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-12組明顯低于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統計學意義。圖4

圖4 各組轉染后大鼠胸大動脈平滑肌細胞P53蛋白水平的蛋白免疫印跡檢測結果

3 討論

大量研究表明，端粒在觸發細胞周期阻滯和細胞凋亡方面起作用。將合成的寡核苷酸序列導入細胞，可阻滯細胞周期導致細胞凋亡[29]。端粒結構的異常在多種細胞系中均能引起細胞凋亡，目前認為真核細胞的分裂增殖潛力由細胞的端粒長度控制，隨著細胞的分裂 , 端粒DNA逐漸丟失[30]。

本實驗研究結果顯示不同端粒寡核苷酸序列引起A7R5細胞的凋亡率不同，具有端粒單鏈結構的TE-12引起細胞凋亡最明顯，其次是具有一個G-四聚體和一個單鏈結構的TE-36，而四個端粒重復序列的TE-24因為形成了一個G-四聚體結構，誘導凋亡作用最弱。這種效應的差別可能是由于端粒單鏈結構能夠模擬端粒開環后3’懸突的暴露，更易被識別為DNA的損傷信號[29-30]。此外，TE-12組、TE-36組、TE-24組的SIRT1mRNA和蛋白水平依次降低，并高于陰性對照組。而TE-12組、TE-36組、TE-24組的P53 mRNA和蛋白表達水平依次降低的，卻低于陰性對照組，可見SIRT1參與了端粒寡核苷酸序列誘導的A7R5的凋亡，同時還下調了P53蛋白的表達水平。綜合以上結果，可以看到TE-12組、TE-24組、TE-36組三組轉染端粒寡核苷酸序列后，SIRT1、P53基因及蛋白水平與細胞凋亡的變化趨勢一致，即TE-12組SIRT1、P53表達最高，凋亡也最明顯。由此提示，端粒寡核苷酸序列可能通過SIRT1/P53途徑促進平滑肌細胞的凋亡，并且對不同序列的調控可能還存在差異。

本研究為端粒寡核苷酸序列對A7R5的作用及相關機制做了新的探討，對血管老化的基礎研究提供了新的思路，但具體調控機制較復雜，尚需進一步深入研究。

[1] Butt HZ, Atturu G, London NJ. Telomere length dynamics in vascular disease: a review. Eur J Vasc Endova Scsurg, 2010, 40: 17-26.

[2] Saliques S, Zeller M, LorinJ. Telomere length and cardiovascular disease. Arch Cardiovasc Dis, 2010, 103: 454-921.

[3] Peng Y, Huang S, Cheng B. Mesenchymal stem cells: a revolution in therapeutic strategies of age-related diseases. Ageing Res Rev, 2013, 12: 103-150.

[4] Nilsson PM. Impact of vascular aging on cardiovascular disease: the role of telomere biology. J Hypertens, 2012, 30: 9-12.

[5] Rubtsova MP, Vasilkova DP, Malyavko AN. Telomere lengthening and other functions of telomerase. Acta Naturae, 2012, 4: 44-61.

[6] Chen C, Mu XY, Zhou Y. Ginsenoside rg1 enhances the resistance of hematopoietic stem/progenitor cells to radiation-induced aging in mice. Acta Pharmacol Sin, 2014, 3: 143-150.

[7] Garcia-Beccaria M, Martinez P, Mendez-Pertuz M. Therapeutic inhibition of trf1 impairs the growth of p53-deficient k-rasg12vinduced lung cancer by induction of telomericdna damage. Embo Mol Med, 2015, 7: 30-49.

[8] Bairley RC, Guillaume G, Vega LR. A mutation in the catalytic subunit of yeast telomerase alters primer-template alignment while promoting processivity and protein-dna binding. J Cell SCI, 2011, 124: 42-52.

[9] Lotfi RA, Zawahry KM, Kamar ZA. Effects of smoking on human telomerase reverse transcriptase expression in the skin. Int J Dermatol, 2014, 53: 5-12.

[10] Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A. AMPK and HIF signaling pathways regulate both longevity and cancer growth: the good news and the bad news about survival mechanisms. Biogerontology, 2016, 17: 655-680.

[11] Calapre L, Gray ES, Kurdykowski S, et al. Heat-mediated reduction of apoptosis in UVB-damaged keratinocytes in vitro and in human skin ex vivo. BMC Dermatol. 2016, 16: 6-10.

[12] Moslehi J, Depinho RA, Sahin E. Telomeres and mitochondria in the aging heart. Circ Res, 2012, 110: 226-371.

[13] Knyphausen P, de Boor S, Kuhlmann N, et al. Insights into lysine deacetylation of natively folded substrate proteins by sirtuins. J Biol Chem, 2016 , 291: 14677-14694.

[14] Impey SG, Hammond KM, Shepherd SO, et al. Fuel for the work required: a practical approach to amalgamating train-low paradigms for endurance athletes. Physiol Rep, 2016, 4: 32-52.

[15] Takahashi-Niki K, Ganaha Y, Niki T, et al. Ariga HDJ-1 activates SIRT1 through its direct binding to SIRT1. Biochem Biophys Res Commun. 2016, 474: 131-136.

[16] 張慶勇, 陳燕萍, 劉芬, 等. 人參皂苷Rg1對大鼠急性心肌缺血抗氧化損傷指標及超微結構的影響. 中國循環雜志, 2015, 30: 164-167.

[17] Asaka R, Miyamoto T, Yamada Y, et al. Sirtuin 1 promotes the growth and cisplatin resistance of endometrial carcinoma cells: a novel therapeutic target. Lab Invest, 2015, 95: 1363-1373.

[18] Lee WY, Lee WT, Cheng CH, et al. Repositioning antipsychotic chlorpromazine for treating colorectal cancer by inhibiting sirtuin 1. Oncotarget, 2015, 6: 27580-27595.

[19] Song TY, Yeh SL, Hu ML, et al. A Nampt inhibitor FK866 mimics vitamin B3 deficiency by causing senescence of human fibroblastic Hs68 cells via attenuation of NAD(+)-SIRT1 signaling. Biogerontology, 2015, 16: 789-800.

[20] Gollavilli PN, Kanugula AK, Koyyada R, et al. AMPK inhibits MTDH expression via GSK3β and SIRT1 activation: potential role in triple negative breast cancer cell proliferation. FEBS J, 2015, 282: 3971-3985.

[21] Carnevale D, Pallante F, Fardella V, et al. The angiogenic factor PlGF mediates a neuroimmune interaction in the spleen to allow the onset of hypertension. Immunity, 2014 , 41: 737-752.

[22] Torma F, Koltai E, Nagy E, et al. Exercise increases markers of spermatogenesis in rats selectively bred for low running capacity. PLoS One, 2014, 9: e114075.

[23] Smit-McBride Z, Forward KI, Nguyen AT, et al. Age-dependent increase in miRNA-34a expression in the posterior pole of the mouse eye. Mol Vis, 2014, 5: 1569-1578.

[24] Asaka R, Miyamoto T, Yamada Y, et al. Sirtuin 1 promotes the growth and cisplatin resistance of endometrial carcinoma cells: a novel therapeutic target. Lab Invest, 2015, 95: 1363-1373.

[25] Park JH, Lee SW, Yang SW, et al. Modification of DBC1 by SUMO2/3 is crucial for p53-mediated apoptosis in response to DNA damage. Nat Commun, 2014, 18: 54-83

[26] 董麗君, 湯寶鵬, 周賢惠, 等. 心房肌基質金屬蛋白酶及其抑制劑、凋亡相關基因表達改變與增齡性心房顫動關系的研究. 中國循環雜志, 2014, 29: 1034-1038.

[27] Shinozaki S, Chang K, Sakai M, et al. Inflammatory stimuli induce inhibitory S-nitrosylation of the deacetylaseSIRT1 to increase acetylation and activation of p53 and p65. Sci Signal, 2014, 7: ra106.

[28] 商青青, 周建業, 胡盛壽. 端粒長度的影響因素及其與心血管疾病的關系. 中國分子心臟病學雜志 , 2012, 2: 125-128.

[29] 呂娟, 王紅. 端粒長度對心血管疾病預測價值的研究進展. 西南國防醫藥, 2016, 3: 42-44.

[30] Zhang L, Yu Y, Xia X, et al. Transcriptionfactor E2-2 inhibits the proliferation of endothelial progenitor cells by suppressingautophagy. Int J Mol Med, 2016,37: 1254-1262.

Different Telomere Fragments Promote Rat’s Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis by Silent Information Regulator 1/Cancer Suppressor Gene P53

LV Juan, WANG Hong.
Kunming Medical University, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Kunming (650031), Yunnan, China

WANG Hong, Email: wangh43@126.com

Objective: To study the influence of different telomere oligonucleotide on rat’s thoracic aortic smooth muscle (A7R5 ) cell apoptosis and to clarify weather silent information regulator 1 (SIRT1)/cancer suppressor gene (P53) signaling pathway involved in oligonucleotide induced cell apoptosis.

Methods: 3 telomere repeat sequences of TE-12 (TTAGGG)2, TE-24 (TTAGGG)4and TE-36 (TTAGGG)6were respectively transfected into rat’s A7R5 cells as TE-12 group, TE-24 group and TE-36 group; in addition, blank A7R5 cells were used as Control group. Transfection induced A7R5 cell apoptosis was detected by flow cytometry, mRNA and protein expressions of SIRT1 and P53 in A7R5 cells were examined by RT-PCR and Western blot analysis in different groups.

Results: Successful ransfection rates were similar among 3 groups. Compared with Control group and TE-36, TE-24 groups, the highest apoptosis rate of A7R5 cells was found in TE-12 group and the lowest was found in TE-24 group which was still higher than that in Control group, all P＜0.05. mRNA and protein expressions of SIRT1 was obviously higher inTE-12 group than the other 3 groups, all P＜0.05; mRNA and protein expressions of P53 was obviously lower in TE-24 group than the other 3 groups, all P＜0.05.

Conclusion: Telomere oligonucleotide sequence may promote rat’s A7R5 cell apoptosis; different sequence had various influence and the strongest effect was observed in TE-12 sequence. The above impact might be related to SIRT1/P53 signaling pathway.

Oligonucleotides; Muscel, smooth, vessel; Apoptosis

2016-09-11）

（編輯：常文靜）

國家自然科學基金（81270224）

650031 云南省昆明市，成都軍區昆明總醫院 高干病房

呂娟 碩士研究生 主要從事冠心病的發病機制和預防研究工作 Email：1962991930@qq.com 通訊作者：王紅 Email:wangh43@126.com

R54

A

1000-3614（2017）06-0612-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.06.019