慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血輔助性T淋巴細胞表達水平分析

侯春陽，馬玉梅，劉 莉，李宗芬

慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血輔助性T淋巴細胞表達水平分析

侯春陽，馬玉梅，劉 莉，李宗芬

目的 探討慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B， CHB)及乙型肝炎后肝硬化(liver cirrhosis， LC)、肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)患者外周血輔助性T淋巴細胞(Th)的表達水平。方法 選擇2014年1—3月建平縣疾病預防控制中心傳染病網(wǎng)絡報告的HBV 34例(CHB組)及2014年1—12月在建平縣疾病預防控制中心登記注冊的乙型肝炎后LC 31例(乙型肝炎后LC組)和乙型肝炎后HCC 29例(乙型肝炎后HCC組)，另選擇2014年1—3月參加建平縣醫(yī)院體格檢查結論健康的志愿者30例(對照組)。所有入選患者均進行Th(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)檢測并比較。結果 4組外周血Th各指標值總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CHB組、乙型肝炎后LC組及乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于對照組，外周血CD8+值均明顯高于對照組；乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組及乙型肝炎后LC組，而CD8+值明顯高于CHB組及乙型肝炎后LC組；乙型肝炎后LC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組，而CD8+值明顯高于CHB組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 CHB及乙型肝炎后LC、HCC患者均存在明確外周血Th異常表達，乙型肝炎后HCC患者最為嚴重。

乙型肝炎,慢性；肝硬化；肝腫瘤；輔助性T淋巴細胞;外周血

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B， CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染所致，并以肝臟慢性炎癥經(jīng)過為主要病理改變，CHB可引起宿主體內(nèi)消化系統(tǒng)多器官損害，部分CHB患者形成肝硬化(liver cirrhosis， LC)，甚至可以進展為肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)，嚴重影響患者存活壽命及生活質量。目前，多數(shù)學者認為人體內(nèi)細胞免疫調節(jié)發(fā)生功能紊亂，未能有效、及時地清除HBV是發(fā)生CHB及其進展成為LC、HCC的主要原因，宿主體內(nèi)細胞免疫應答狀態(tài)對CHB預后及轉歸起主導作用，其中輔助性T淋巴細胞(Th，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)在上述過程中扮演重要角色[1-3]。國內(nèi)專門觀察CHB、LC及HCC患者外周血Th組間表達差異性及探討HBV 對機體細胞免疫功能影響的研究不多。為此，我們選擇2014年在遼寧省建平縣疾病預防控制中心調查登記的CHB、LC及HCC患者為研究對象，觀察他們外周血Th表達水平，并與對照組進行比較，現(xiàn)分析報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2014年1—3月經(jīng)遼寧省建平縣疾病預防控制中心傳染病網(wǎng)絡報告的HBV患者及2014年1—12月在建平縣疾病預防控制中心登記注冊的乙型肝炎后HCC和LC患者。將符合納入及排除標準的CHB 34例作為CHB組，乙型肝炎后LC 31例作為乙型肝炎后LC組，乙型肝炎后HCC 29例作為乙型肝炎后HCC組。另選擇2014年1—3月參加建平縣醫(yī)院體格檢查結論健康的志愿者30例作為對照組。CHB組男21例(61.76%)，女13例(38.24%)；年齡19～62(35.71±8.40)歲。LC組男20例(64.52%)，女11例(35.48%)；年齡25～66(34.25±8.91)歲。HCC組男20例(68.97%)，女9例(31.03%)；年齡25～65(36.12±7.56)歲。對照組男19例(63.33%)，女11例(36.67%)；年齡21～69(34.90±6.78)歲。4組性別及年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.229，P=0.516;χ2=0.734,P=0.982)。

1.2 納入及排除標準 納入標準：①符合HBV感染后不同臨床分型疾病診斷標準。②在建平縣居住5年以上。排除標準：①甲、丙、丁、戊及其他型病毒性肝炎患者；②自身免疫性疾病患者；③乙醇、血吸蟲及藥物等其他原因引起肝損害患者；④近1年接受抗病毒及免疫調節(jié)治療患者；⑤接受手術及介入治療患者。

1.3 CHB、LC及HCC診斷標準 ①CHB及LC診斷標準：選擇2010年由中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會感染病學分會修訂的“CHB防治指南[4]”中的CHB及LC診斷標準。②HCC診斷標準：選擇2001年中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會修訂的“原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準[5]”中的HCC診斷標準。

1.4 外周血Th表達水平測定 采取各組空腹靜脈血8 ml，高速離心后，分離血清，保存于-18℃低溫冰箱待檢。外周血Th (CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)表達水平測定應用美國FC-500-MPL流式細胞儀，采用四色熒光標記流式細胞技術進行檢測。血液標本采集均在入選后10 d內(nèi)進行。

2 結果

4組外周血Th各指標值總體比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CHB組、乙型肝炎后LC組及乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于對照組(t=2.615、P=0.012，t=2.490、P=0.017，t=2.453、P=0.018；t=2.004、P=0.041，t=2.373、P=0.022，t=2.560、P=0.014；t=2.397、P=0.019，t=2.469、P=0.018，t=2.482、P=0.017)，外周血CD8+值均明顯高于對照組(t=2.452、P=0.018，t=2.516、P=0.016，t=2.172、P=0.038)，差異均具有統(tǒng)計學意義。乙型肝炎后HCC 組外周血CD3+、CD4+及CD4+/ CD8+值均明顯低于CHB組及乙型肝炎后LC組(t=2.438、P=0.018，t=2.040、P=0.045;t=2.519、P=0.016，t=2.357、P=0.024;t=2.473、P=0.017，t=1.986、P=0.046)，而CD8+值明顯高于CHB組及乙型肝炎后LC組(t=2.552、P=0.037，t=1.821、P=0.047)；乙型肝炎后LC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組(t=1.025、P=0.049；t=1.376、P=0.048；t=1.865、P=0.046)，而CD8+值明顯高于CHB組(t=1.419、P=0.048)，差異亦均具有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 CHB、乙型肝炎后LC、乙型肝炎后HCC組及對照組4組外周血輔助性T淋巴細胞各指標表達水平比較±s)

注：CHB為慢性乙型肝炎，LC為肝硬化，HCC為肝癌；與對照組比較，aP<0.05；與乙型肝炎后HCC組比較，cP<0.05；與乙型肝炎后LC組比較，eP<0.05

3 討論

肝臟是一個易誘導產(chǎn)生免疫耐受的特殊器官，HBV就是引起這樣細胞破壞的嗜肝臟 DNA 病毒， CHB患者的先天性免疫與后天獲得性免疫都存在某些缺陷，HBV感染并不直接損傷他們的肝細胞，而是誘導宿主體內(nèi)發(fā)生自身免疫反應，間接傷害肝細胞，這一類細胞免疫反應在HBV感染初期即對宿主轉歸和預后發(fā)揮著影響，并成為CHB后發(fā)生LC及HCC的重大影響因素[6-7]。不同個體感染 HBV后轉歸及結局存在顯著區(qū)別，有相當比例感染人群死于CHB后LC及HCC，故探討HBV感染后結局差異的免疫學機制成了感染科室專家和學者們的關注熱點。在這里面，自然包括了Th所扮演的角色，CD4+ Th屬于人體免疫應答調節(jié)中樞，協(xié)助 B細胞進行分化和產(chǎn)生抗體，CD4+又分為Th1和Th2兩個細胞亞群，前者主要分泌干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素(IL)-2，參與遲緩型細胞免疫反應；后者主要產(chǎn)生IL-4、IL-5因子及合成免疫球蛋白E(IgE)，增強體液免疫應答。在HBV持續(xù)作用下，這2類細胞因子數(shù)量發(fā)生了動態(tài)波動致使Th1/Th2 失衡，這是決定CHB發(fā)生不同轉歸的重要免疫學病因[8-9]。目前，國內(nèi)外多篇文獻報道涉及了Th參與肝臟免疫及炎癥反應經(jīng)過內(nèi)容[6-7,9]，提出了一些觀點與看法。本文選擇2014年1—3月遼寧省建平縣疾病預防控制中心傳染病網(wǎng)絡報告的HBV患者及2014年1—12月在建平縣疾病預防控制中心登記注冊的乙型肝炎后LC及乙型肝炎后HCC患者為研究對象，觀察不同結局HBV感染患者外周血Th表達水平變化，并與2014年1—3月在建平縣醫(yī)院進行體格檢查的健康者進行比較，結果顯示CHB組、乙型肝炎后LC組及乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于對照組，外周血CD8+值均明顯高于對照組；乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組及乙型肝炎后LC組，而CD8+值明顯高于CHB組及乙型肝炎后LC組；乙型肝炎后LC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組，而CD8+值明顯高于CHB組，差異均具有統(tǒng)計學意義。提示CHB及乙型肝炎后LC、乙型肝炎后HCC患者均存在明確外周血淋巴細胞各亞群比例失衡及Th表達異常，乙型肝炎后HCC患者最為嚴重。有部分學者認為，CHB、乙型肝炎后LC及乙型肝炎后HCC患者外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值表達低下代表著這些宿主體內(nèi)持續(xù)存在著HBV感染，并遭遇后者不斷刺激，呈反復復制活動，并且這些Th相關指標體內(nèi)表達強度不同帶來了HBV感染患者不同結局[10-12]。一些國內(nèi)學者應用不同方法進行類似研究，得出了與本研究較為一致結論[13-14]。

總之，在HBV感染過程中，宿主體內(nèi)發(fā)生了Th表達異常，Th1/Th2失衡程度決定著CHB病程遷延程度和(或)是否轉歸為其他更為嚴重的結局(乙型肝炎后HCC和LC)。Th相關指標可作為HBV感染免疫學病因診斷、選擇治療及療效評估的定量標識，也開辟了對這一患病群體進行分級預防及免疫治療的新途徑。

[1] Rehermann B. Pathogenesis of chronic viral hepatitis: differential roles of T cells and NK cells[J].Nat Med， 2013，19(7):859-868.

[2] 楊春，秦波.HBV感染后免疫耐受形成機制的研究進展[J].中國病原生物學雜志，2013，8(11)：1033-1035.

[3] 王曉瓊，張國慶，劉中芹，等.山東省壽光市乙型肝炎、乙型肝炎相關肝硬化及肝癌流行趨勢分析[J].疾病預防控制通報，2015,10(4):46-48,91

[4] 中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中國病毒病雜志，2011，1(1):9-23.

[5] 楊秉輝，夏景林.原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準[J].中華肝臟病雜志，2001，9(6):324.

[6] Kennedy P T, Sandalova E, Jo J,etal. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B[J].Gastroenterology, 2012,143(3):637-645.

[7] 張敏，楊麗莎，彭德珍，等.慢性 HBV 感染不同免疫狀態(tài)及乙肝肝硬化外周血T、B細胞亞群和NK細胞的變化及意義[J].實用醫(yī)學雜志，2014，30(20)：3233-3236.

[8] Li J， Han Y， Jin K，etal. Dynamic changes of cytotoxic t lymphocytes (ctls), natural killer (nk) cells, and natural killer t (nkt) cells in patients with acute hepatitis b infection[J].Virol J， 2011，8(2):199.

[9] Dimitropoulou D， Karakantza M， Tsamandas A C，etal. T-lymphocyte subsets in peripheral blood and liver tissue of patients with chronic hepatitis B and C[J].In Vivo， 2011，25(5):833-840.

[10]葉玲麗，鄭加勇，方深慧，等.慢性乙肝患者外周血免疫活性淋巴細胞與病毒載量及肝細胞損傷程度的關系[J].實用醫(yī)學雜志，2009，25(6)：892-894.

[11]Liu C， Wang Y M， Fan K. Epidemiological and clinical features of hepatitis B virus related liver failure in China[J].WorId J Gastroenterol， 2011，17(25):3054-3059.

[12]Lopes A R， Ellam P， Das A，etal. Bim-mediated deletion of antigen specific CD8 T cells in patients unable to control HBV infection[J].J Clin Invest, 2008,118(5):1835-1845.

[13]劉寧，徐杰，劉金花，等.慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、乙肝肝癌患者 Th1/Th2 型細胞因子水平變化研究[J].胃腸病學和肝病學雜志，2014，23(2):158-161.

[14]梁勁松，鄧鑫，文彬，等.不同臨床類型乙型病毒性肝炎患者淋巴細胞亞群的差異性分析[J].醫(yī)學研究雜志，2015，44(2)：75-77.

Expression Levels of Helper Lymphocyte T in Peripheral Blood of Patients with Chronic Hepatitis B, Liver Cirrhosis after Hepatitis B and Hepatocellular Carcinoma

HOU Chun-yang1, MA Yu-mei1, LIU Li2, LI Zong-fen3

(1. The Second Department of Infection, the Sixth People Hospital of Shenyang, Shenyang 110006, China; 2. Center for Disease Prevention and Control of Liaoning Province, 110005 Shenyang, China; 3. Center for Disease Prevention and Control of Jianping County, Jianping, Liaoning 122400, China)

Objective To investigate expression levels of helper T lymphocyte (Th) in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B (CHB), liver cirrhosis (LC) after hepatitis B infection and hepatocellular carcinoma (HCC). Methods A total of 34 hepatitis B virus (HBV) patients (CHB group) reported in legal infectious diseases network of Jianping County from January to March in 2014, 31 LC patients after hepatitis B infection (LC group) registered from January to December 2014, 29 HCC patients after hepatitis B infection (HCC group) registered in disease prevention and control center of Jianping County from January to March in 2014 and 30 healthy people taking physical examination from January to March in 2014 (control group) were recruited in this study. Detections of T cells (CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/ CD8+) were performed for all the groups. Results There were significant differences in Th index values in peripheral blood in the four groups (P<0.05). Values of CD3+, CD4+ and CD4+/CD8+ in peripheral blood were significantly lower, while CD8+ values in peripheral blood were significantly higher in CHB, LC and HCC groups than those in control group; values of CD3+, CD4+ and CD4+/ CD8+ in peripheral blood were significantly lower, while CD8+ value was significantly higher in HCC group than those in CHB and LC groups; values of CD3+, CD4+ and CD4+/ CD8+ in peripheral blood was significantly lower, while CD8+ value was significantly higher in LC group than those in CHB group (P<0.05). Conclusion Abnormal expression of Th in peripheral blood can be found in patients with CHB, LC after hepatitis B infection and HCC after hepatitis B infection, and HCC patients after hepatitis B infection are especially severe.

Hepatitis B, chronic; Liver cirrhosis; Liver neoplasms; Helper T cells; Peripheral blood

遼寧省科技惠民計劃專項資助項目(2013GS210102)

110006 沈陽，沈陽市第六人民醫(yī)院感染二科病房(侯春陽、馬玉梅)；110005 沈陽，遼寧省疾病預防控制中心(劉莉)；122400 遼寧 建平，建平縣疾病預防控制中心(李宗芬)

R512.62；R575.2；R735.7

A

1002-3429(2017)05-0098-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.05.030

2017-02-11 修回時間：2017-03-10)