TGF-β1/Smad3在博來霉素肺纖維化大鼠中的作用

邱 靜，李萬成

1.成都醫學院 基礎醫學院 (成都 610500)；2.成都醫學院第一附屬醫院 呼吸內科 (成都610500)

·論著·

TGF-β1/Smad3在博來霉素肺纖維化大鼠中的作用

邱 靜1，李萬成2△

1.成都醫學院 基礎醫學院 (成都 610500)；2.成都醫學院第一附屬醫院 呼吸內科 (成都610500)

目的 通過Smad3特異性抑制劑(specific inhibitor of Smad3，SIS3)干預博來霉素肺纖維化大鼠，觀察轉化生長因子β1(TGF-β1)、Smad3蛋白表達情況，探討TGF-β1/Smad3信號通路在肺纖維化中的作用。方法 選取健康成年雄性SD大鼠60只，隨機分為4組：生理鹽水對照組(NS組)，博來霉素組(BLM組)，SIS3干預組(SIS3組)，二甲基亞砜溶媒組(DMSO組)，每組15只。BLM組、SIS3組和DMSO組氣管內注射博來霉素溶液(5 mg/kg)建立大鼠肺纖維化模型；NS組以同樣方法注入等量生理鹽水；SIS3組大鼠腹腔內注射SIS3(2.5 μg/g)干預處理，BLM組注射等量生理鹽水，DMSO組注射等量DMSO。各組于造模后第7、14、28天分別處死5只大鼠，行Masson染色觀察各組肺組織膠原纖維差異。免疫組化檢測各組TGF-β1、Smad3表達情況。結果 與NS組比較，BLM組、DMSO組大鼠肺組織出現明顯纖維化，TGF-β1、Smad3表達明顯增高；與BLM組、DMSO組相比，SIS3組大鼠肺纖維化程度減輕，TGF-β1、Smad3表達減少。結論 SIS3干預肺纖維化大鼠，能夠減輕大鼠肺泡炎，降低肺纖維化程度；TGF-β1/Smad3信號通路在肺纖維化中可能起到重要作用。

肺纖維化；Smad3特異性抑制劑；轉化生長因子β1；Smad3蛋白

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性間質性肺病，早期病理改變為肺泡炎，此后纖維化逐漸加重，肺功能呈進行性減退，病因不明[1]。IPF屬慢性進行性發展的致死性疾病，預后差，中位生存時間為2～2.8年。糖皮質激素和/或免疫抑制劑等常規治療措施有效率不足30%，因此，尋找新治療藥物意義重大[2]。本研究通過Smad3特異性抑制劑(specific inhibitor of Smad3，SIS3)對博來霉素誘導肺纖維化大鼠進行干預，以探討TGF-β1/Smad3在肺纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠，共60只，雄性，8～10周齡，體質量(250±50)g，SPF級，由成都達碩實驗動物有限公司提供，分籠飼養，自由飲水與攝食。

1.1.2 藥物與試劑 注射用鹽酸博來霉素(海正輝瑞制藥有限公司),SIS3(美國Sigma公司)，DMSO(武漢博士德生物公司)，Masson染色試劑盒(福建邁新生物技術開發有限公司)，兔抗大鼠TGF-β1單抗、DAB顯色試劑盒和HRP免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)，兔抗大鼠Smad3單抗(北京博奧森生物技術公司)。

1.1.3 主要儀器 石蠟包埋機、(半自動石蠟切片機德國SLEE公司)，CUT 5062，ZT-12K生物組織自動脫水機(湖北孝感亞光醫用電子技術研究所)，高壓鍋(上海實驗儀器總廠)，離心機(美國賽默飛Thermo)，MCS7200顯微圖像采集系統(德國Leica)，雙目數字顯微鏡(德國Leica DMS300)，去離子水制備機(德國ELGA公司)，移液器(德國普蘭德Brand)，冰箱(青島海爾集團有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 取體質量(250±50)g，健康雄性SD大鼠，周齡8～10周，SPF級，實驗條件下飼養1周，隨機分為生理鹽水對照組(NS組)，博來霉素組(BLM組)，SIS3干預組(SIS3組)和二甲基亞砜溶媒組(DMSO組)，每組15只。

1.2.2 動物模型建立 4組大鼠給予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，固定于操作臺，無菌操作下頸正中切開，暴露氣管。BLM組、SIS3組、DMSO組在環狀軟骨下端經氣管間隙緩慢注入博來霉素溶液(5 mg/kg)，注射劑量0.3 mL，注射后將動物直立旋轉，使藥液在肺內分布均勻，建立大鼠肺纖維化模型；NS組以同樣方法氣管內注射無菌生理鹽水0.3 mL；SIS3組腹腔內注射SIS3(2.5 μg/g)進行干預處理，劑量為0.5 mL，2次/周；DMSO組腹腔內注射等量DMSO作為對照，NS組、BLM組腹腔內注射等量生理鹽水作為對照。

1.2.3 標本采集 4組大鼠分別于第7、14、28天3個時間點處死，每個時間點處死5只。10%水合氯醛麻醉后固定于操作臺，開胸取肺，右肺于4%中性甲醛溶液中固定24 h后石蠟包埋、切片，分別行Masson染色及免疫組化檢測。

1.3 肺纖維化指標檢測

1.3.1 Masson染色圖像分析 使用全自動計算機圖像分析系統Image Pro-Plus6.0對Masson染色切片進行膠原纖維染色面積測定。通過irregular工具選中的預檢測區域(area of interest,AOI)，計算膠原著色的面積及AOI面積，分析膠原著色面積與AOI面積之比，得出膠原所占比例。

1.3.2 免疫組化染色圖像分析 使用全自動計算機圖像分析系統Image Pro-Plus6.0對免疫組化染色結果進行半定量分析，計算積分光密度值(IOD)。每張免疫組化切片均采取200倍視野下觀察并采集圖像，隨機選擇5個視野進行采圖，測定其陽性染色的IOD值，以其均值反映表達量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 肺組織病理學改變

顯微鏡下觀察NS組大鼠第7、14、28天Masson染色，肺泡結構正常，肺泡間隔無增厚，未見充血、水腫病灶，未見明顯藍色膠原沉積。BLM組大鼠第7天Masson染色肺泡結構大體正常，開始出現大量中性粒細胞等炎性細胞滲出，肺泡壁稍增厚，少量藍色膠原纖維滲出；第14、28天大鼠肺泡結構破壞嚴重，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔融合、陷閉，肺泡形態基本消失，大量藍色膠原纖維填充；與NS組大鼠相比，BLM組纖維化程度加重，藍染膠原面積明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。SIS3組大鼠第7天肺泡結構出現破壞，炎性細胞滲出較多，少量藍染膠原纖維滲出，第14、28天肺泡結構被大量破壞，大量炎細胞及藍色膠原纖維沉積，肺泡結構尚存；較BLM 組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。DMSO組第7、14、28天肺組織Masson染色與BLM組相似，差異無統計學意義(P>0.05)(圖1,表1)。

圖1 大鼠肺組織Masson染色(100×)

注：A1、A2、A3為NS組第7、14、28天Masson染色； B1、B2、B3為BLM組第7、14、28天Masson染色； C1、C2、C3為SIS3組第7、14、28天Masson染色； D1、D2、D3為DMSO組第7、14、28天Masson染色

2.2 免疫組化結果

2.2.1 TGF-β1免疫組化結果 NS組大鼠第7、14、28天TGF-β1在肺泡巨噬細胞中呈弱陽性。BLM組第7、14、28天肺組織巨噬細胞及血管內皮細胞TGF-β1明顯表達，陽性表達區域逐漸增大，與NS組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。SIS3組大鼠表達趨勢與BLM組相似，但低于BLM組，差異具有統計學意義(P<0.05)。DMSO組大鼠表達與BLM組相似，差異無統計學意義(P>0.05)(圖2，表2)。

表1 4組肺組織Masson染色面積比

注：與NS組相比，aP<0.05；與BLM組相比，bP<0.05

表2 4組大鼠肺組織免疫組化TGF-β1表達結果±s，平均積分光密度)

注：與NS組相比，aP<0.05；與BLM組相比，bP<0.05

2.2.2 Smad3免疫組化結果 NS組大鼠第7、14、28天Smad3在肺泡巨噬細胞呈弱陽性表達。BLM組第7、14、28天肺組織巨噬細胞及血管內皮細胞Smad3明顯表達，陽性表達區域逐漸增大，與NS組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。SIS3組Smad3的表達趨勢與BLM組相似，但低于BLM組，差異具有統計學意義(P<0.05)。DMSO組與BLM組表達相似，差異無統計學意義(P>0.05)(圖3，表3)。

圖2 大鼠肺組織TGF-β1免疫組化(200×)

注：圖A1、A2、A3為NS組第7、14、28天免疫組化；圖B1、B2、B3為BLM組第7、14、28天免疫組化；圖C1、C2、C3為SIS3組第7、14、28天免疫組化；圖D1、D2、D3為DMSO組第7、14、28天免疫組化

表3 4組大鼠肺組織免疫組化Smad3表達結果(平均積分光密度，±s)

注：與NS組相比，aP<0.05；與BLM組相比,bP<0.05

圖3 大鼠肺組織Smad3免疫組化(200×)

注：A1、A2、A3為NS組第7、14、28天免疫組化；B1、B2、B3為BLM組第7、14、28天免疫組化；C1、C2、C3為SIS3組第7、14、28天免疫組化；D1、D2、D3為DMSO組第7、14、28天免疫組化

3 討論

IPF是一種慢性進行性、纖維化性間質性肺炎，為臨床最常見的一種特發性間質性肺炎，組織學和/或胸部HRCT特征性表現為UIP，主要病理特征為肺間質及肺泡腔內纖維增生和炎細胞浸潤合并存在。本研究通過大鼠氣管內注射博來霉素模擬出IPF病理組織特點的肺纖維化動物模型，為目前公認的經典的研究肺纖維化方法之一[3]。Masson染色結果提示BLM組肺纖維化程度較NS組明顯加重，說明BLM誘導大鼠肺纖維模型成功。同時，SIS3組大鼠肺纖維化程度較BLM組明顯減輕，表明SIS3干預措施可成功減輕大鼠肺纖維化。DMSO組與BLM組肺纖維化程度相似，表明DMSO溶媒對肺纖維化無干預作用。目前IPF的治療缺乏直接對預后因素或治療反應起到決定性作用的藥物，糖皮質激素或免疫抑制劑、細胞毒藥物仍是其主要的治療藥物，其療效均欠佳，臨床不足30%的病人對治療有反應，且可出現毒副反應[2-3]，因此尋找新藥及新的分子治療靶點意義重大。

TGF-β1被證實是肺纖維化形成與發展的關鍵因子，能促進成纖維細胞趨化，促使膠原合成及改變細胞外基質成分。Smad蛋白是TGF-β下游信號轉導和調節分子，參與TGF-β信號細胞內傳導[4]。磷酸化的Smad2、3與Smad4形成Co-Smads進入細胞核調控靶基因轉錄，誘導肺組織纖維化改變[5]。本研究中博來霉素誘導大鼠肺纖維化的形成，TGF-β1、Smad3的表達明顯增加，證實TGF-β1/Smad3為肺纖維化發病機制之一。因此，調控TGF-β1/Smad3可能成為肺纖維化治療的新切入點。

SIS3具有強效、高選擇性抑制Smad3的功能。Jinnin等[6]研究證明，SIS3可抑制TGF-β1誘導的磷酸化Smad3，Smad3與Smad4相互作用以及Smad3與細胞核DNA結合，同時不影響Smad2磷酸化。SIS3可減弱TGF-β1轉錄活性，抑制TGF-β1誘導成肌纖維細胞轉化為成纖維細胞。SIS3通過選擇性抑制Smad3，成為評價TGF-β1調節細胞機制的有用工具。Li等[7]研究表明，SIS3在早期糖尿病腎病中可抑制內皮間質轉化發生，從而延緩糖尿病腎臟纖維化的發展。本研究通過SIS3干預博來霉素誘導的肺纖維化大鼠，結果表明SIS3干預組大鼠，肺纖維化程度較BLM組減輕，表明SIS3可減輕肺纖維化程度。

綜上所述，TGF-β1/Smad3是肺纖維化形成的重要機制之一，實驗結果表明，SIS3可特異性抑制Smad3蛋白表達，阻斷TGF-β1細胞內信號傳導，抑制肺纖維化的形成，為肺纖維化新藥的開發及臨床應用提供新的方向。

[1]李萬成. SU5416在博來霉素肺纖維化小鼠中的抗纖維化機制研究[D]. 成都：四川大學, 2007：11.

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A Study on the Role of TGF-β1/Smad3 in Rats with Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis

Qiu Jing1, Li Wancheng2△.

1. School of Basic Medical Sciences, Chengdu Medical College, Chengdu 610500,China; 2. Department of Respiratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To observe the expressions of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and Smad3 protein in rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis via the intervention of specific inhibitor of Smad3 (SIS3) and explore the role of TGF-β1/Smad3 signaling pathway in pulmonary fibrosis. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into four groups including the normal saline control group (NS group), bleomycin group (BLM group), SIS3 intervention group (SIS3 group), and dimethyl sulfoxide (DMSO group), and each group consisted of 15 rats. The rats in the BLM, SIS3 and DMSO groups were given intratracheal injection with bleomycin solution (5 mg/kg) to establish the rat models with pulmonary fibrosis, while the rats in the NS group was injected with the same amount of normal saline. The rats in the SIS3 group were injected intraperitoneally with SIS3 (2.5 μg/g), those in the BLM group were injected with the same amount of normal saline, and those in the DMSO group were injected with the same amount of dimethyl sulfoxide. Five rats of each group were sacrificed on the 7th, 14th and 28th day after the modeling. The Masson staining was applied to observe the differences of collagen fibers in lung tissues, and the immunohistochemical staining was adopted to detect the expressions of TGF-β1, Smad3 in each group. Results Compared with the NS group, the lung tissues of the BLM and DMSO groups showed significant fibrosis and the expressions of TGF-β1 and Smad3 were significantly increased. Compared with the BLM and DMSO groups, the degree of pulmonary fibrosis were decreased in the SIS3 group and the expressions of TGF-β1 and Smad3 were decreased. Conclusion Firstly, SIS3 can alleviate alveolitis and reduce the pulmonary fibrosis in rats with pulmonary fibrosis. Secondly, the TGF-β1/Smad3 signaling pathway may play an important role in pulmonary fibrosis.

Pulmonary fibrosis; Specific inhibitor of Smad3; Transforming growth factor-β1; Smad3 protein

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170222.1401.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.03.007

R563

A

△通信作者：李萬成， E-mail:316608439@qq.com