血漿miR-192表達與丙泊酚全麻下肝臟腫瘤切除術肝損傷相關性研究

解康杰 凌志強 連燕虹 余江流 韓靜 方軍

血漿miR-192表達與丙泊酚全麻下肝臟腫瘤切除術肝損傷相關性研究

解康杰 凌志強 連燕虹 余江流 韓靜 方軍

目的 評估外周血miR-192表達與丙泊酚全麻下肝臟腫瘤切除術肝損傷的相關性，探討循環血中miR-192可否作為肝臟腫瘤術后肝損傷的生物標志物。方法 選取行肝臟腫瘤擇期手術的患者101例，記錄患者一般狀況、麻醉藥物及麻醉方法，腫瘤大小、手術類型、是否肝門阻斷、術中出血量，術后12～24h內患者的肝腎功能。術后第1天取外周血測定循環血中miR-192濃度。應用統計學方法分析循環血中miR-192水平與手術肝損傷的相關性。結果 術中出血量≥500ml的患者，術后ALT、AST、miR-192升高幅度顯著高于出血量＜500ml的患者，差異有統計學意義（P=0.046、0.020、0.000）。有肝門阻斷的患者，術后miR-192升高幅度顯著高于無肝門阻斷患者，差異有統計學意義（P=0.001）。miR-192與ALT、AST均呈正相關（r=0.930、0.744，P=0.000、0.000）。術中丙泊酚用量與術后ALT、AST、miR-192均呈正相關（r=0.231、0.248、0.232，P=0.020、0.012、0.020）。手術持續時間與術后ALT、AST、miR-192均呈正相關（r=0.184、0.241、0.185，P=0.011、0.001、0.011）。結論 血漿miR-192表達與丙泊酚全麻下肝臟腫瘤切除術肝損傷具有良好的相關性，miR-192可能對缺血性肝損傷和創傷性肝損傷較為敏感，可以作為肝臟腫瘤切除術肝損傷的標志物。

miR-192 丙泊酚 肝腫瘤切除術 肝損傷

肝臟腫瘤是常見的消化道惡性腫瘤，手術切除是肝臟腫瘤有效治療方法之一[1]。肝臟腫瘤手術治療過程中會伴隨有麻醉藥物肝毒性、出血、肝門阻斷至缺血再灌注損傷、術中電刀燒灼傷及機械性損傷、炎癥、內毒素血癥等肝損傷并發癥。目前評價肝損傷的丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）也有局限性，可出現假陽性或假陰性，如在腎損傷和骨骼肌損傷時也可檢測到血清ALT升高，臨床上很容易錯過肝損傷最佳治療時期。近年來循環血中microRNA有望成為肝損傷的生物標記物[2]。小鼠實驗證明miR-122和miR-192評估藥物性肝損傷靈敏度遠高于ALT[3]。本研究通過檢測外周血miR-192水平表達，評估其與丙泊酚全麻下肝腫瘤切除術后肝損傷的相關性，探討循環血中miR-192可否作為肝臟腫瘤術后肝損傷的生物標志物，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2011年5月至2012年7月擇期行肝臟腫瘤切除手術的患者。排除標準：術前已經有嚴重肝功能損傷或腎功能損傷、同一次住院期間行第2次肝臟手術、存在影響生存的嚴重原發性疾病患者。共納入研究101例患者，其中男79例（78.2%），女22例（21.8%）；年齡18～78歲，其中40～64歲患者84例（占83.2%）。體重過輕4例，正常體重72例（占71.3%），體重過重20例，肥胖5例。ASAⅠ級9例，Ⅱ級89例，Ⅲ級3例。本研究經醫院倫理委員會同意，患者或其授權的家屬簽署書面同意書。

1.2 麻醉方法 麻醉采用全憑靜脈全麻。患者入手術室后采用多參數監護儀（美國Datex-Ohmeda S/5）行心電圖、血氧飽和度及無創血壓連續監護；麻醉前完成有創橈動脈直接測壓（美國ICUmedical公司）及右頸內靜脈置管（德國B.Braun Certofix Duo V720）行中心靜脈壓力監測；連接腦電雙頻譜指數（bispectral index，BIS）監護儀（美國Aspect Vista公司）行術中持續鎮靜深度監測。全麻誘導采用咪達唑侖（江蘇恩華藥業股份有限公司，規格：5mg:5ml）0.05mg/kg、芬太尼（宜昌人福藥業有限責任公司，規格：0.5mg:5ml）4μg/kg、丙泊酚（英國阿斯利康公司，規格：500mg:50ml）1.0～1.5mg/kg、羅庫溴銨（美國默沙東公司，規格：50mg:5ml）0.08mg/kg，氣管插管后采用間歇正壓通氣，潮氣量為8～10ml/kg，呼吸頻率10次/min，吸呼比1∶2，維持呼氣末二氧化碳分壓（PETCO2）在30～40mmHg。麻醉維持依據BIS及術中血流動力學變化采用丙泊酚6～10mg/（kg·h）、瑞芬太尼（宜昌人福藥業有限責任公司，規格：1mg/瓶）0.1～0.3μg/（kg·h）、羅庫溴銨0.04～0.08 mg/（kg·h）。維持術中收縮壓的波動幅度不超過基礎值25%。手術結束前30min停止給予肌松藥，靜脈注射芬太尼0.1mg。

1.3 觀察指標 （1）術前一般資料：年齡、性別、ASA分級、BMI、術前血常規及肝腎功能、術前合并癥、原發性還是轉移性肝腫瘤。（2）記錄術中腫瘤大小、是否肝門阻斷、術中出血量。（3）記錄術后12～24h內患者的肝腎功能。（4）術后第1天抽取外周血測定循環血中miR-192水平，miR-192測定水平除以20例正常人（隨機選取本院職工健康體檢血樣，已經告知并簽知情同意書）均值得出miR-192倍數，正常范圍為0.5～2.0倍，低于0.5倍為下調，高于2.0倍為上調。

1.4 miR-192水平測定 （1）于手術結束后12～24h內用BD肝素鋰真空采血管抽取靜脈血5ml，貯存于4℃。在4℃下分別以1 200×g和12 000×g各離心10min。取250μl血漿置于無RNA/DNA酶的離心管中，并加入750μl的TRIzol LS（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），混勻，室溫靜置5min后于-80℃低溫保存。（2）血漿總RNA的提取：取已加入TRIzol LS的血漿，加入1pmol athmiR-159a（由中國銳博生物科技有限公司合成）使溶液充分混合。之后用TRIzol LS，參照miRNA分離試劑盒說明書中的步驟提取總RNA。提取的RNA沉淀重新懸浮于25μl不含核酸酶的水并儲存在-80℃。（3）逆轉錄及定量PCR檢測miR-192的表達：從重新懸浮總RNA 的25μl溶液中取3μl等分試樣，使3μl總RNA聚腺苷酸化并使用試劑盒逆轉錄為cDNA（One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis kit，日本Takara公司）。隨后，將cDNA稀釋7.5倍，取2μl稀釋的cDNA作為模板。最后，稀釋的cDNA與miRNA的特異性引物、SYBR-Green Mix（Takara）在ABI 7500實時PCR系統（ABI PRISM）運行qRT-PCR。miRNA表達的循環閾值（Ct）的值標準化為ath-miR-159a（U6）。數據采用2-△△CT法分析miR-192表達的相對變化[3-4]。

1.5 統計學處理 應用SPSS 22.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料組間比較采用Pearson χ2檢驗；等級資料比較采用Hruskal-Wallis H秩和檢驗。正態分布的雙變量資料采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 肝臟腫瘤及手術狀況 101例患者中合并乙肝65例（占64.4%）；原發性肝臟腫瘤有96例（占95.0%），轉移性肝臟腫瘤5例；惡性腫瘤97例（占96.0%），良性腫瘤有4例；腫瘤＞5cm患者44例（占43.6%）。合并肝臟外其它系統的腫瘤9例。手術過程中未行肝門阻斷患者31例（占30.7%），肝門阻斷患者70例（占69.3%）。術中出血量＞500ml患者14例（占13.9%），有12例患者（11.9%）進行輸血。

2.2 二分類變量術后miR-192、AST、ALT水平比較 男性患者術后第1天ALT和miR-192較女性患者明顯升高，差異均有統計學意義（P=0.031、0.001）。術中出血量≥500ml的患者，術后ALT、AST、miR-192升高幅度顯著高于出血量＜500ml的患者，差異均有統計學意義（P=0.046、0.020、0.003）。有肝門阻斷的患者，術后miR-192術后升高幅度顯著高于無肝門阻斷患者，差異有統計學意義（P=0.035），詳見表1。

表1 術后miR-192、AST、ALT水平比較

2.3 三分類變量術后miR-192、AST、ALT水平比較 不同年齡階段、不同ASA分級的患者術后miR-192、AST、ALT水平的比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表2。

2.4 miR-192與ALT、AST水平相關性分析 研究結果顯示miR-192與ALT、AST水平均呈正相關（r= 0.930、0.744，P=0.000、0.000），表明miR-192可作為預測肝腫瘤手術肝損傷的標記物（見圖1）。

2.5 術中丙泊酚用量、手術持續時間與術后ALT、AST、miR-192相關性分析 研究結果示術中丙泊酚用量與術后ALT、AST、miR-192水平均呈正相關（r=0.231、0.248、0.232，P=0.020、0.012、0.020）。手術持續時間與術后ALT、AST、miR-192均呈正相關（r=0.184、0.241、0.185，P=0.011、0.001、0.011）。但是如果控制時間因素做偏相關分析，丙泊酚與術后ALT、AST、miR-192無相關性。如果控制術中丙泊酚用量因素作偏相關分析，手術持續時間與術后ALT、AST、miR-192無相關性。詳見圖2-5。

3 討論

miR-192是人體正常腎臟、肝臟及結腸組織中富含的一種miRNA，在結腸癌、肝癌、肺癌等腫瘤組織中表達降低，被認為是一種腫瘤抑制性miRNA[5-6]。小鼠實驗證明miR-192評估藥物性肝損傷敏感性遠高于ALT，miR-192是評估肝損傷的有前途的生物標志物[3]。Roy 等[7]動物試驗也認為miR-192-5p參與急性肝損傷期間肝細胞死亡的調節，并且可能代表肝損傷的有效標記物。本研究目的在于評估外周血中miR-192表達與丙泊酚全麻下肝癌切除術肝損傷的相關性，探討循環血中miR-192可否作為肝癌術肝損傷的生物標志物。

本研究共納入101例患者，男性顯著多于女性，40歲以下的患者7例，40～64歲的患者84例，占83.2%，65歲及以上的患者10例，可以看出肝臟腫瘤多分布在40～64歲這個年齡段的人群中。男性患者組術后第1天ALT值和miR-192較女性患者明顯升高，可能與肝癌患者男性所占百分比較高。另外性激素在肝癌發生和進展中有一定作用，男性在肝細胞性肝癌患者中占絕大多數，為女性的8倍多[8]。術中出血量≥500ml的患者，術后ALT、AST、miR-192升高幅度顯著高于出血量＜500ml的患者，表明手術術中出血量對于術后肝功能有影響。有肝門阻斷的患者，術后miR-192升高幅度顯著高于無肝門阻斷患者，差異有統計學意義，說明miR-192對缺血性肝損傷的靈敏度高于傳統的肝損傷標記物。

表2 術后miR-192、AST、ALT水平比較

圖1 miR-192與ALT及AST水平相關性分析

圖2 丙泊酚用量與ALT及AST水平相關性分析

圖3 丙泊酚用量與miR-192水平相關性分析

圖4 手術持續時間與ALT、AST水平相關性分析

術中丙泊酚用量、手術持續時間與術后ALT、AST、miR-192具有相關性。但是如果控制時間因素做偏相關分析，丙泊酚與術后ALT、AST、miR-192無相關性。如果控制術中丙泊酚用量因素做偏相關分析，手術持續時間與術后ALT、AST、miR-192無相關性。所以術中丙泊酚用量與術后ALT、AST、miR-192的相關性可能是由于手術創傷大、時間長的肝臟手術術中丙泊酚用量相應增加有關。與丙泊酚本身對肝臟的作用是否有關尚需進一步研究證實。本結果可以間接說明miR-192與手術創傷大小具有一定的相關性。研究顯示miR-192與ALT值具有良好的相關性，miR-192與AST值也有較好的相關性，表明miR-192可作為預測肝腫瘤術后肝損傷的生物學標記物。Krauskopf等[9]研究證明，血漿miR-192表達與藥物誘導的肝損傷相關，miR-192可以作為評價藥物性肝損傷及恢復的標記物。Nagano等[4]研究microRNA評估納米材料誘導的肝損傷實驗中也證明miR-192是良好的肝損傷標志物。Church等[10]動物研究認為miR-122-5p和miR-192-5p是良好表征的肝損傷標記物。本研究也證明miR-192可以作為評估手術創傷性肝損傷的標記物。

圖5 手術持續時間與miR-192水平相關性分析

綜上所述，本研究表明血漿miR-192表達與丙泊酚全麻下肝腫瘤切除術肝損傷具有良好相關性。miR-192可能對缺血性肝損傷和創傷性肝損傷較為敏感，可以作為肝腫瘤切除術肝損傷的標志物。

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Correlation between plasma miR-192 expression and liver injury after liver resection under general anesthesia with propofol

XIE Kangjie,LING Zhiqiang,LIAN Yanhong,et al.Department of Anesthesiology,Zhejiang Caner Hospital,Hangzhou 310022,China

miR-192 PropofolLiver cancer resection Liver injury

2016-05-27）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省醫藥衛生科技計劃項目一般研究計劃（2010KYA038）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫院麻醉科（解康杰、連燕虹、方軍），浙江省腫瘤研究所（凌志強、余江流、韓靜）

方軍，E-mail：fangjunok@126.com

【 Abstract】 Objective To evaluate the relationship between miR-192 expression and hepatic injury after liver tumor resection under general anesthesia with propofol. Methods One hundred and one patients who underwent elective liver tumor resection were enrolled in the study.The general condition,anesthetic drugs,anesthesia methods,tumor size,operation type, portal triad clamping,intraoperative blood loss were recorded.The liver and kidney functions of the patients were measured 12－24 hours after operation.The concentration of miR-192 in peripheral blood was measured on the first day after operation.The correlation between miR-192 in circulating blood and postoperative liver injury was analyzed. Results Postoperative ALT,AST, miR-192 levels was significantly higher in patients with intraoperative blood loss≥500ml than those in patients with blood loss＜500ml(P=0.046,0.020,0.000).There was a significant increase in the postoperative miR-192 levelin patients with hilar interruption compared with those without hilar interruption(P=0.001).MiR-192 was positively correlated with ALT and AST(r=0.930,0.744, P=0.000,0.000).The dosage ofpropofolwas positively correlated with ALT,ASTand miR-192(r=0.231,0.248,0.232,P=0.020, 0.012,0.020).The duration of operation was positively correlated with ALT,AST and miR-192(r=0.184,0.241,0.185,P=0.011, 0.001,0.011). Conclusion This study shows that the expression of miR-192 in plasma has a good correlation with liver injury after liver tumor resection under general anesthesia with propofol.MiR-192 may be sensitive to ischemic liver injury and traumatic liver injury and may be used as a postoperative marker ofliver injury after liver tumor resection.