血必凈聯合法舒地爾對膿毒癥急性腎損傷后腎小管細胞凋亡的影響

孫雪東 嚴一核 劉芳 褚韋韋 張亦婷 應利君

血必凈聯合法舒地爾對膿毒癥急性腎損傷后腎小管細胞凋亡的影響

孫雪東 嚴一核 劉芳 褚韋韋 張亦婷 應利君

目的 探討早期應用血必凈聯合法舒地爾對膿毒癥急性腎損傷后腎小管細胞凋亡的影響及機制。方法 將60只雄性SD大鼠隨機分為分假手術組、膿毒癥組、血必凈組、法舒地爾組和聯合用藥組，每組12只。以盲腸結扎穿孔法制造膿毒癥模型，假手術組麻醉后開腹翻動腸道，隨即關腹；膿毒癥組按4ml/kg尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液；血必凈組按4ml/kg注射血必凈；法舒地爾組按20mg/kg注射鹽酸法舒地爾；聯合用藥組予等劑量血必凈和法舒地爾注射。在造模后6、24h再將每組隨機分為2個亞組，每個亞組6只。檢測各時間點大鼠的腎功能和炎癥指標，觀察腎小管病理改變、測定腎小管損傷評分，采用TUNEL法觀察腎小管凋亡細胞，并計算凋亡指數(AI)。用免疫印跡法測定ROCK-1、MYPT-1和caspase-3表達的變化。結果 （1）造模后24h時與膿毒癥組相比，各用藥組腎功能均能明顯改善（P＜0.05），在抑制TNF-α、IL-6表達上聯合用藥組優于兩單藥組（均P＜0.05）。（2）造模后24h時聯合用藥組與兩單藥組比較，腎小管損傷評分和AI值明顯降低（均P＜0.05）。（3）造模后24h時聯合用藥組與兩單藥組比較，更能抑制MYPT-1的磷酸化，促使caspase-3表達下降（均P＜0.05）。結論 膿毒癥早期血必凈聯合法舒地爾可以通過Rho/ROCK信號通路抑制凋亡蛋白的表達，減少腎小管細胞在膿毒癥進程中的凋亡，發揮協同作用減輕膿毒癥導致的急性腎損傷。

血必凈 法舒地爾 膿毒癥急性腎損傷凋亡 Rho激酶

嚴重膿毒癥往往引起多臟器功能不全，患者病死率高達25%～80%[1]，在ICU中是導致患者死亡的主要原因之一。近年來，細胞凋亡通路的激活被認為是導致膿毒癥急性腎損傷的重要原因，Rho被認為是細胞內信號傳遞的分子啟動因子[1-2]；阻斷該信號通路可以減少炎性介質的生成，減輕炎性反應和細胞的凋亡。而血必凈注射液可以通過抑制膿毒癥時失控的炎癥反應，減少細胞的凋亡和組織的氧化損傷，被廣泛應用于膿毒癥的臨床治療[2]；法舒地爾是目前唯一應用于臨床的Rho酶抑制劑，能改善微循環，可擴張入球小動脈和收縮出球小動脈，使腎小球濾過率增加，同時通過Rho/ROCK通路抑制細胞的凋亡，改善內毒素所致的急性腎損傷后腎功能和腎臟病理改變，減輕炎性反應[3]。由于臨床上少有兩藥聯用的報道，因此筆者將血必凈聯合法舒地爾應用于膿毒癥急性腎損傷大鼠模型，觀察兩者在Rho/ROCK信號通路上對膿毒癥急性腎損傷的作用和對腎小管細胞凋亡的影響，以及兩藥聯用可否起到協同作用，并探討其可能的作用機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠60只，體重180～220g，由浙江大學醫學院實驗動物中心提供和飼養；合格證號: SYXK（浙）2010-0126。實驗造模前適應性飼養1周。血必凈注射液（天津紅日公司，10ml/支），鹽酸法舒地爾射液（天津紅日公司，30mg/支）。ELISA法試劑盒（上海生化公司）。原位細胞凋亡檢測（TUNEL）試劑盒、DAB試劑盒（上海生化公司），免疫組化試劑盒：ROCK-1（英國Abcam公司）、caspase-3（美國Cell Signal公司）、p-MYPT-1（英國Abcam公司）、total-MYPT-1（英國Abcam公司）、β-actin（美國Santa Cruz公司）。

1.2 動物模型的制作和分組 參照文獻[5]以盲腸結扎穿孔法（cecalligation and puncture,CLP）制造膿毒癥模型，以隨機數字表法分成假手術組、膿毒癥組、血必凈組、法舒地爾組和聯合用藥組，每組12只；對各組分別以造模后6、24h作為觀察點再以隨機數字表法分為2個亞組，每個亞組6只。CLP后0.5h大鼠出現精神軟弱、活動減少、毛色雜亂無光澤、呼吸稍促、喜飲水、解稀便，說明動物模型制作成功[5-6]。假手術組麻醉后開腹翻動腸道，隨即關腹；膿毒癥組CLP后0.5h尾靜脈按4ml/ kg注射0.9%氯化鈉注射液；血必凈組CLP后0.5h尾靜脈按4ml/kg注射血必凈；法舒地爾組CLP后0.5h尾靜脈按20mg/kg注射鹽酸法舒地爾；聯合用藥組予等劑量血必凈和法舒地爾尾靜脈注射。首次給藥后每12h重復給藥1次。所有大鼠在手術后均常規予以注射30ml/kg 的0.9%氯化鈉注射液復蘇。

1.3 生化和炎癥指標的檢測 在造模后6、24h用戊巴比妥50mg/kg經大鼠進行腹腔注射麻醉，剖腹暴露腎臟，并經腹主動脈采血、切取腎臟標本。用全自動生化儀（日本日立7600）檢測血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）。用ELISA法檢測血液中TNF-α、IL-6水平，按說明書操作。

1.4 病理組織學檢測 對腎臟組織常規用10%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片和HE染色。在光鏡下觀察腎組織的病例變化，進行腎臟腎小管損傷評分的評定，作半定量分析。腎損傷定義為：腎小管退化、空泡變性，管型形成，小管壞死和炎癥浸潤。評分標準：0分，正常組織；1分，單細胞、點灶性壞死；2分，腎小管受損面積≤25%；3分，腎小管受損面積26%～50%；4分，腎小管受損面積51%～75%；腎小管受損面積≥76%[5]。

1.5 TUNEL法測定腎小管凋亡細胞 采用TUNEL試劑盒并按試劑盒的說明進行操作來檢測凋亡的DNA碎片：將石蠟切片脫蠟脫水，用蛋白酶K孵育，微波修復抗原，滴加TUNEL反應液，滴加辣根過氧化物酶標抗熒光素抗體工作液，用DAB顯色劑呈色；最后脫水、透明、封片。在光鏡下觀察，細胞核呈棕黃色，即為陽性細胞。每視野內陽性細胞占總細胞數的百分率即為凋亡指數（apoptotic index，AI），即AI＝陽性細胞/總細胞數× 100%。采用Image-Pro Plus-6.0軟件對圖像的AI進行盲法分析。

1.6 免疫印跡法測定ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達 取新鮮腎臟髓質40mg在400μl的RIPA裂解液（50 mMTris-HCl pH 7.4，150 mMNaCl，1mM PMSF，1%NP-40）中進行勻漿，然后在4℃下進行12 000r/min離心15min×2，除去未破裂的細胞、細胞核和線粒體。細胞上清液轉移到新的試管，測定總蛋白濃度。所有細胞上清液調整到相同的蛋白濃度，并在SDS緩沖液65℃中加溫15min，保存于-20℃備用。進行SDS-PAGE電泳、轉膜，用一抗ROCK-1（1∶1 000）、caspase-3（1∶800）、p-MYPT-1（1∶1 000）、total-MYPT-1（1∶500）、β-actin（1∶2 000）孵育過夜，最后用二抗（兔抗鼠，1∶500）孵育2h，ECL試劑顯色，JY-Clear ECL型化學發光凝膠成像分析系統進行成像。ROCK-1、caspase-3的表達用各自蛋白的表達與內參β-actin比值表示，MYPT-1的表達用p-MYPT-1/total-MYPT-1比值表示。

1.7 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時點腎功能變化和炎癥指標的比較各組大鼠造模6h后Cr、BUN水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；24h后各組大鼠Cr、BUN水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），且24h后膿毒癥組Cr水平明顯高于假手術組（P＜0.05），各用藥組Cr水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.05），但3組用藥組間的Cr水平無統計學差異；聯合用藥組BUN水平均低于其他單藥組（P＜0.05），而兩單藥組與膿毒癥組比較無統計學差異。各組大鼠6、24h后TNF-α、IL-6水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；各用藥組6、24h后TNF-α、IL-6水平均低于膿毒癥組（均P＜0.05），聯合用藥組低于兩單藥組（P＜0.05），但兩單藥組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠不同時點腎功能變化和炎癥指標的比較

2.2 各組大鼠腎組織病理改變和腎小管損傷評分的比較 假手術組腎小管病理基本正常；膿毒癥組見明顯腎小管壞死，透明管型并伴有大量單核細胞浸潤；血必凈組、法舒地爾組腎小管空泡變性減少，單核細胞浸潤明顯減少；聯合用藥組局部腎小管空泡變，詳見圖1（見插頁）。各組大鼠造模6、24h后腎小管損傷評分比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；膿毒癥組造模6h后腎小管損傷評分高于假手術組（P＜0.05），聯合用藥組評分明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）；其余各組比較無統計學差異。24h時膿毒癥組和各用藥組評分均高于假手術組（均P＜0.05），兩單藥組與膿毒癥組比較無統計學差異，但聯合用藥組明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）,詳見表2。

2.3 TUNEL法檢測腎小管凋亡細胞 結果顯示，假手術組無凋亡細胞；膿毒癥組顯示簇狀、隊列狀排列的凋亡細胞；血必凈組和法舒地爾見分散分布的凋亡細胞，聯合用藥組見少量分散隊列狀凋亡細胞，提示膿毒癥導致腎小管細胞的凋亡，詳見圖2（見插頁）。各組大鼠造模6h后AI比較無統計學差異（P＞0.05），24h后差異有統計學意義（P＜0.05）。各用藥組造模24h后AI值均明顯低于膿毒癥組（均P＜0.05），聯合用藥組均低于兩單藥組（均P＜0.05），兩單藥組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表3。

表2 各組各時點腎小管損傷評分的比較（分）

表3 各組大鼠腎小管凋亡情況的比較（%）

2.4 各組大鼠ROCK-1、MYPT-1和caspase-3表達的比較 各組大鼠造模6h后ROCK-1、MYPT-1比較均無統計學差異（均P＞0.05），而capase-3在各組中有統計學差異（均P＜0.05）；造模24h后各組ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。造模6h后capase-3表達在各用藥組低于膿毒癥組（P＜0.05），聯合用藥組低于兩單藥組（P＜0.05）。造模24h后ROCK-1在各用藥組的表達高于膿毒癥組（P＜0.05），但各用藥組間比較無統計學差異；MYPT-1和caspase-3在聯合用藥組的表達低于膿毒癥組，且低于兩單藥組（P＜0.05），見表4、圖3。

3 討論

膿毒癥是感染后導致的全身炎癥反應綜合征，嚴重膿毒癥可導致多器官功能障。根據臨床治療和文獻報道，膿毒癥發生6h后可檢測到血清中多種炎癥介質增高，如果6h內有效的集束化治療可以明顯改善膿毒癥預后，24h后臨床指標明顯改善，大大增加患者的生存率[4]；因此本研究選用造模后6、24h兩個時點予以觀察。研究表明，近半數的膿毒癥患者在病程中出現膿毒性急性腎損傷（SI-AKI）使患者病死率成倍增加甚至高達75%[1-2]。目前細胞凋亡通路的激活被認為是導致早期急性膿毒性腎損傷的重要原因[5]，本研究從中藥血必凈聯合法舒地爾入手，從Rho/ ROCK信號通路來探討對SI-AKI的腎小管細胞凋亡的保護作用。

表4 各組大鼠各時點ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達

圖3 各組大鼠造模24h后ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達

凋亡是指程序性死亡，是一個清除壞死和異常細胞的自我保護機制。Rho相關激酶ROCK是絲氨酸/蘇氨酸相關的異構體，被認為是Rho蛋白的效應蛋白，在細胞凋亡的起始階段發揮重要作用[6-7]。ROCK蛋白廣泛存在與哺乳動物內，包括ROCK-1和ROCK-2；ROCK-1主要存在與肝、腎、睪丸等非神經組織[8]。ROCK通過磷酸化下游肌球蛋白結合亞基磷酸酶靶蛋-1(MYPT-1)從而實現細胞調節功能[9]。同時，caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡階段體內caspase-3可以使ROCK-1發生構象性改變，導致ROCK-1處于持續性活化狀態[10-11]。抑制capase-3、MYPT-1的表達可以減少效應蛋白ROCK-1的表達，從而減少腎小管細胞的凋亡，改善腎臟灌注和腎功能有重要意義[12]。

血必凈是在“菌、毒、炎”并治的理論指導下研制而成的水性注射液，能抑制多種細胞炎癥因子；主要成分有川芎、赤芍、丹參、紅花等提取物，具有行氣活血、清熱涼血、解毒止痛的功效，能擴張外周微血管，具有改善組織灌注與微循環，能抑制過度的炎性介質釋放[13-14]。而法舒地爾是目前唯一應用于臨床的ROCK抑制劑，有抑制鈣敏化效應，利于血管平滑肌的舒張，可擴張入球小動脈和收縮出球小動脈，使腎小球濾過率增加，同時降低炎性介質的形成，能減輕炎性反應，減少氧自由基的生成[15-16]。同時國內學者瞿星光等[4]通過實驗認為法舒地爾可以改善內毒素所致的急性腎損傷后腎功能和病理損傷減輕炎性反應；通過直接抑制ROCK-l活性，并下調GRP78、CHOP等炎癥蛋白，抵抗內質網過度應激所致的損傷[3，15]。本研究免疫印跡法測定結果發現：膿毒癥發生后MYPT-1磷酸化增加、caspase-3表達不斷增強，導致ROCK-1處于持續激活狀態，從而產生一系列的病理性損害；血必凈和法舒地爾應用24h時均可以減少MYPT-1的磷酸化，阻止ROCK-1在膿毒癥中的過度表達，同時可以使caspase-3表達降低。從炎癥因子角度出發，兩藥聯用在膿毒癥早期6h時，即可抑制TNF-α、IL-6的表達；從生化和組織學上來看，在膿毒癥發生后各用藥組24h時均能明顯改善腎功能的惡化，減輕腎臟組織學的形態學改變；從TUNEL免疫染色來看能夠明顯減少腎小管細胞的凋亡。但兩藥聯用對抑制caspase-3、MYPT-1的表達和降低AI值來看可協同發揮作用，更好地抑制腎小管細胞的凋亡。這些證據表明血必凈能夠通過Rho激酶通路抗腎小管細胞的凋亡。

綜上所述，筆者認為Rho/ROCK通路與膿毒癥性急性腎損傷密切相關，早期聯合應用血必凈和法舒地爾可以改善膿毒癥導致急性腎損傷的病理學改變，減少腎小管細胞在膿毒癥進程中的凋亡。單味中藥往往療效甚微，和法舒地爾聯用充分發揮了中西醫結合的協同效應[17-18]，為兩藥聯用治療SI-AKI提供了實驗依據；但對于臨床的應用仍然有待進一步的深入研究。

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Inhibitory effects of Xuebijing injection combined with fasudil on tubular apoptosis in sepsis-induced acute kidney injury of rats

SUN Xuedong,YAN Yihe,LIU Fang,et al.Department of Critical Care Medicine,Shaoxing People's Hospital,Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect of Xuebijing combined with fasudil on tubular apoptosis in sepsis-induced acute kidney injure(SI-AKI)of rats. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into five groups:sham group,sepsis group,Xuebijing group,fasudil group and combination group with 12 rats in each group.Sham operation was performed in rats of sham group;SI-AKI were induced by cecal ligation and puncture(CLP)surgery in other 4 groups.0.9%sodium chloride at 4ml/kg,Xuebijing at 4ml/kg,fasudil at 20mg/kg and Xuebijing with fasudil were injected via caudal vein in sepsis group,Xuebijing group,fasudil group and combination group,respectively.Six rats were sacrificed in each group at 6h and 24h after treatment, respectively.Renal function parameters,inflammation factors,pathological changes of tubules,renal tubular injury score were measured.The apoptosis of renal tubular cells was determined by TUNEL method,apoptotic indices (AI)were calculated.The expressions of ROCK-1,MYPT-1 and caspase-3 were detected by Western blot. Results At 24h after treatment,the renal function in 3 treatment groups was significantly improved compared to sepsis group (P＜0.05).The TNF-α,IL-6 levels in combination group were lower than those in other two treatment groups(all P＜0.05).The tubular damage scores and AI values in combination group were more attenuated compared to other two treatment groups(all P＜0.05).The phosphorylation of MYPT-1 was more markedly inhibited and the caspase-3 expression was decreased in combination group compared to other two treatment groups(all P＜0.05). Conclusion Early application of Xuebijing combined with fasudil can alleviate renal dysfunction and pathological changes,reduce the tubular cell apoptosis in SI-AKI rats,in which the Rho-kinase signaling pathway may be involved.

Xuebijing FasudilSepsis acute kidney injury apoptosis Rho-kinase

2016-09-19）

（本文編輯：嚴瑋雯）

紹興市科技計劃（2014B70066）

312000 紹興市人民醫院重癥醫學科（孫雪東、嚴一核、褚韋韋、張亦婷、應利君），病理科（劉芳）

孫雪東，E-mail：drsxd@tom.com